[發明專利]失活和提取耐酸細菌以用于使用質譜分析法表征和/或鑒定的方法

在審

• 申請號: 201380025243.4
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN104284985A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 瓊斯·M·海曼;帕拉姆帕爾·多爾;伊麗莎白·米勒;維多利亞·吉拉德;安布爾·蓋茨;桑德琳·麥勒;莫德·阿爾薩克;約翰·沃爾什
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃有限公司
• 主分類號: C12Q1/24
• 分類號: C12Q1/24;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 王思琪;鄭霞

相關申請的交叉引用

本申請要求2013年3月14日提交的美國專利申請號13/828,119、標題為“Methods?for?Inactivation?and?Extraction?of?Acid-Fast?Bacteria?for?Characterization?and/or?Identification?Using?Mass?Spectrometry”的，以及2012年5月17日提交的美國臨時專利申請號61/648,420、標題為“Methods?for?Inactivation?and?Extraction?of?Mycobacteria?for?Characterization?and/or?Identification?using?Mass?Spectrometry”的權益，其并入本文。

發明領域

本發明涉及用于失活和提取耐酸細菌，諸如分枝桿菌屬(Mycobacteria)和諾卡氏菌屬(Nocardia)的方法。特別是，本發明涉及使用質譜分析法快速表征和/或鑒定測試樣品中的分枝桿菌或諾卡氏菌的方法。

發明背景

傳統的自動化表型ID測試，諸如Phoenix^TM和系統，或手動表型測試諸如API要求，微生物處于適當的生長階段并且無干擾培養基和血液制品，以提供穩健的結果。這些系統使用來自陽性肉湯在平板培養基上生長18-24小時的菌落。然而，為了獲得更快的結果，一些實驗室已報道了使用這些系統及從陽性血液培養瓶分離的微生物。這些直接來自培養瓶的試驗并不是對于所有的微生物(例如，革蘭氏陽性球菌))都是適當的，未經測試廠商驗證，并且一般要花費3-8小時才能提供結果。迫切需要更快速且寬廣的特異性測試，以在陽性培養結果之后的最初幾個小時內、優選地1小時內為醫師提供臨床上相關的結果。

質譜方法具有允許非常快速地鑒定微生物的潛能，但可遇到來自液體微生物培養基中和臨床樣品諸如血液或其組合中存在的許多化合物的干擾。用于直接從陽性血液培養肉湯中回收微生物的最常用的方法是兩步差速離心和在血清分離器管中的離心。

用于分離、表征和/或鑒定微生物的其他方法已被描述，包括：

美國專利號6,177,266公開了用由基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析法(matrix?assisted?laser?desorption?ionization?time-of-flight?mass?spectrometry)(MALDI-TOF-MS)分析細胞的蛋白提取物或全細胞產生的屬、種和菌株特定生物標志物化學分類細菌的方法。

然而，本領域中仍存在對微生物測試樣品的失活和/或提取用于隨后通過質譜分析法分析、表征和/或鑒定的有效且快速的方案的需要。特別是，失活或細胞死亡通常對于耐酸細菌諸如分枝桿菌屬和諾卡氏菌屬在生物安全級別-3(BSL-s/P3)環境外的后續處理是必需的。

發明概述

在一方面，本發明涉及用于失活和/或提取測試樣品中的耐酸細菌的方法，該方法包括以下連續步驟：(a)從已知包含或可能包含耐酸細菌(例如，分支桿菌或諾卡氏菌)的固體或半固體培養基中獲得測試樣品，并將測試樣品懸浮于包含乙醇和珠的容器中；(b)珠磨和/或渦旋容器以打碎容器中的團塊和/或破壞容器中的耐酸細菌細胞；以及(c)隨后溫育懸浮液至少約3分鐘，以失活測試樣品中包含的任何耐酸細菌。耐酸細菌(例如，分枝桿菌或諾卡氏菌)樣品可用接種環或拭子從固體或半固體培養基中獲得。

在一個實施方案中，步驟(a)中的容器可包含從約50％至約100％乙醇，例如，容器可包含約70％乙醇。方法還可包括珠磨或渦旋步驟(b)中的容器約1分鐘至約30分鐘。在另一個實施方案中，珠為0.5mm的玻璃珠。在一個實施方案中，隨后溫育步驟(c)包括溫育至少約3分鐘，或者至少約10分鐘。在另一個實施方案中，步驟(c)中的溫育為在室溫。

在另一個實施方案中，方法還可包括以下另外的連續步驟：(d)離心容器以沉淀耐酸細菌(例如分枝桿菌或諾卡氏菌)樣品，并除去上清液；(e)在甲酸中重懸耐酸細菌沉淀；以及(f)隨后將乙腈加入至容器。任選地，方法還包括在步驟(f)之后離心容器中的測試樣品。在另一個任選的實施方案中，來自步驟(d)的上清液可直接或作為水懸浮液應用至質譜載玻片或板。