[發明專利]制備生理活性多肽復合物的改進方法

在審

• 申請號: 201380023673.2
• 申請日: 2013-03-08
• 公開（公告）號: CN104271604A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 張明賢;金玟永;李鐘守;金大振;裴城敏;權世昌
• 申請（專利權）人: 韓美科學株式會社
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/10;A61K47/48
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民;陸惠中

技術領域

本發明涉及制備復合物的方法，該復合物中的生理活性多肽通過含兩個或更多個醛作為官能團的非肽基聚合物連接體共價結合至免疫球蛋白恒定區。更具體地，本發明涉及有效制備生理活性多肽復合物的方法，其特征在于通過在制備時調整還原劑的使用來改進低產率和多肽試劑變形的問題。

背景技術

總體而言，生理活性多肽由于它們的低穩定性而容易變性，并且在血液中容易經歷蛋白水解降解和隨后的腎或肝臟清除。因此，含生理活性多肽作為藥物成分的蛋白質藥物需要頻繁地對患者給藥，以維持適當的血清水平和效價。然而，此類蛋白質藥物的頻繁給藥(其大多數是以注射的形式)引起患者疼痛而且治療成本高。為了解決這些問題，已經投入許多努力來改進蛋白質藥物的血清穩定性，和使血液中的藥物長期維持在高水平以使藥物的藥效達到最大。作為長效制劑使用的需求，蛋白質藥物必須配制成具有高穩定性并且維持足夠高水平的效價而不引發患者的免疫應答。

傳統的穩定蛋白質和防止酶降解及腎臟清除的方法是用具有高溶解度的聚合物(例如，聚乙二醇(在下文中稱為“PEG”)對蛋白質藥物的表面進行化學修飾。通過結合至目標蛋白的特定區域或各種區域，PEG使得蛋白質的溶解度更高，從而穩定蛋白質并防止水解而不引起嚴重的副作用(Sada等人，J.發酵生物工程(J.Fermentation?Bioengineering)71:137-139)。

例如，WO?2006/076471公開了通過將B-型鈉尿肽(BNP)與PEGs結合而使其長效的方法，該PEGs結合至鈉尿肽受體A(NPR-A)以引發cGMP的合成，從而降低動脈血壓。其因而用于充血性心力衰竭的治療。美國專利號6,924,264描述了一種通過使其賴氨酸殘基PEG化來改進艾塞那肽(exendin-4)在體內的持續時間的方法。然而，在此方法中，盡管其有能力通過增加PEG的分子量來增加肽藥物的循環時間，但PEG化仍有問題，例如，大大降低了肽藥物的效價和降低了產率，這是因為隨著PEG的分子量增加，肽的反應性下降。

WO?02/46227公開了這樣的融合蛋白，其中GLP-1和艾塞那肽(exendin-4)或其類似物與人血清白蛋白或通過遺傳重組制備的免疫球蛋白片段(Fc)結合。美國專利號6,756,480涉及這樣的融合蛋白，其中甲狀旁腺激素(PTH)或其類似物連接至Fc。雖然這些方法可被評估為PEG化問題——例如低產率和非特異性——的解決方案，但是已經顯示其增加目標肽的體內半衰期的效果不顯著，與預期相反，而且在某些情況下，融合蛋白具有低效價。雖然多種肽基連接體被利用以使增加血清半衰期的效果達到最大，但它們有可能引起免疫應答。此外，具有二硫鍵的肽(例如，BNP)在實際應用中有困難，因為其很容易引起錯誤折疊。此外，不可能通過遺傳重組產生具有非天然氨基酸殘基的肽基連接體。

胰島素是由人胰腺β-細胞分泌的肽，主要是調節體內血糖水平。當胰島素分泌不正常或分泌的胰島素無法在體內適當地發揮作用時，血糖水平不能被控制并且升高，導致糖尿病。后一種情況稱為2型糖尿病。然而，在胰島素不能從胰腺分泌并且引起血糖水平升高的情況下，導致1型糖尿病。2型糖尿病患者用口服降血糖劑治療，其中一些患者用胰島素治療。同時，對于1型糖尿病患者基本上需要注射胰島素。

通常，通過在每餐之前或之后每天注射三次來施用胰島素進行胰島素療法。然而，每天三次連續胰島素給藥對于患者是痛苦的而且不方便。已經做出很多嘗試來解決這些問題。旨在提高蛋白質藥物在生物膜中的通透性的一種策略是通過口或鼻吸入來遞送藥物。然而，與注射相比，通過口或鼻吸入給藥的遞送效率明顯地低，并且難以將肽藥物維持在體內活性所需的水平。

作為可供選擇的策略，可以將過量藥物皮下注射并以延遲的方式吸收至體內，以維持恒定的血液水平，即使每天注射一次。一些藥物(例如，蘭德仕(Lantus))、賽諾菲安萬特(Sanofi-aventis))已被批準用于商業用途并且目前已對患者給藥。另外，已經針對用脂肪酸修飾胰島素進行了研究以使胰島素結合物的結合更強并通過在注射位置或血液中與白蛋白組合來延長持續時間。一些藥物(例如，諾和平(Levemir)、諾和諾德(NovoNordisk))已被批準用于商業用途。然而，這些藥物在注射位置引起疼痛并且必須每天注射一次，這對患者仍是巨大的負擔。