[發(fā)明專利]角質酶變體以及對其進行編碼的多核苷酸

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• 申請日: 2013-04-30
• 公開（公告）號: CN104271737A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設計）人: A.巴蘇;S.奈克;S.梅帕達姆瓦蘇;P.普里蒂什;R.賽基亞;A.斯文德森
• 申請（專利權）人: 諾維信公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

對序列表的引用

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發(fā)明背景

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及角質酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產生這些變體的方法以及使用這些變體的方法。

相關技術說明

角質酶是能夠水解底物角質的脂肪分解酶。已知角質酶來自各種真菌(P.E.科拉圖庫蒂(Kolattukudy)于“脂酶(Lipases)”，編輯B.柏格斯卓姆和H.L.布羅克曼(Brockman)，愛思唯爾(Elsevier)1984,471-504)，例如來自豌豆根腐鐮孢(Fusarium?solani?pisi)(S.隆吉(Longhi)等人，分子生物學雜志(Journal?of?Molecular?Biology)，268(4),779-799(1997))和特異腐質霉(US?5827719)的角質酶。來自特異腐質霉的角質酶的變體從例如WO?00/34450中已知。

角質酶可被用于丙烯酸酯的聚合中。丙烯酸酯是工業(yè)上重要的具有廣泛商業(yè)應用的化合物。在這些分子中存在的α-雙鍵可被用于聚合以產生終產品，如油漆、塑料和粘合劑。傳統(tǒng)上，丙烯酸和甲基丙烯酸的酯類是在高溫下用聚合抑制劑和用硫酸作為催化劑來化學地制備的。丙烯酸酯的酶轉酰基作用是傳統(tǒng)化學的一個“綠色”選擇并且可以提供從葡萄糖和乳酸等可再生能源起始到丙烯酸酯的可持續(xù)路線。

本發(fā)明提供了與其親本相比具有改進的特性的一種親本角質酶的變體，特別是具有增加的轉酰基活性的變體。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及一種親本角質酶的分離的變體，該變體包括在與SEQ?ID?NO:2的成熟多肽的氨基酸殘基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相對應的一個或多個位置處的取代，該取代選自下組，該組由以下各項組成：P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q，并且該變體具有角質酶活性。

本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞；以及產生這些變體的方法。

本發(fā)明還涉及修飾表面、將植物生物質中的膠質轉化為化學原料以及再循環(huán)聚酯的方法。

定義

角質酶：術語“角質酶”意指具有角質酶活性(EC3.1.1.74)的一種脂肪分解酶，該酶催化以下反應：根據(jù)http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme處可獲得的酶命名法，能夠水解底物角質的脂肪分解酶被歸類為EC3.1.1.74。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)實例中所述的程序確定角質酶活性。在一個方面，本發(fā)明的變體具有SEQ?ID?NO:2的成熟多肽的角質酶活性的至少20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。

等位基因變體：術語“等位基因變體”意指占用同一染色體位點的一種基因的兩個或更多個替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產生，并且可以導致群體內的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。

cDNA：術語“cDNA”是指可以通過得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反轉錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應基因組DNA中的內含子序列。早先的初始RNA轉錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經一系列的步驟進行加工，包括剪接。

編碼序列：術語“編碼序列”意指一種多核苷酸，該多核苷酸直接規(guī)定了一種變體的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由一個開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以一個終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是一種基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。