[發(fā)明專利]靶DNA富集和測序在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201380022651.4 | 申請日： | 2013-04-29 |
| 公開（公告）號： | CN104271770A | 公開（公告）日： | 2015-01-07 |
| 發(fā)明（設計）人： | H·韋德勒;E·韋德勒;D·勞弗特;D·奧尼爾 | 申請（專利權(quán)）人： | 奇亞根有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 北京北翔知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285 | 代理人： | 張廣育;姜建成 |
| 地址： | 德國*** | 國省代碼： | 德國;DE |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | dna 富集 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學的領(lǐng)域、核酸測序的領(lǐng)域，以及更具體地屬于DNA序列富集和測序的領(lǐng)域。
背景技術(shù)
多年以來，在基因組分析的領(lǐng)域中的研究已經(jīng)從僅測序幾個核苷酸發(fā)展到測序全基因組。
高通量測序儀，也稱為“下一代”(next-gen或ngs)、或有時候稱為“第二代”(和第三代相對)測序儀是將能夠輸出十萬到數(shù)百萬個讀長(read)(覆蓋了數(shù)百萬個堿基或數(shù)十億個堿基對(Gbp))的技術(shù)。該技術(shù)被用于(重)測序基因組、測定蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合位點(ChIP-seq)、測序轉(zhuǎn)錄組(RNA-seq)(參見最后一段)。
生產(chǎn)商和技術(shù)分別如下：Solexa/Illumina(產(chǎn)生最高達600Gb的36或150bp的讀長)、Roche/454(產(chǎn)生最高達700Mbp的400-1000bp的讀長)、ABI/SOLiD(產(chǎn)生>20Gb/天的35-75bp的讀長)、Helicos(產(chǎn)生21-35Gb的25-45bp的讀長)和Complete?Genomics(一家服務公司)。
這些技術(shù)將序列信息的分析帶入另一層面。重新考慮實驗是至關(guān)重要的。
例如，如果想要分析所有已知的致癌基因(已知大約3000個與癌癥相關(guān)的基因(M.E.Higgins?et?al.CancerGenes:a?gene?selection?resource?for?cancer?genome?projects.Nature?Methods.2007?35(1).Pp.D721-D726))，必須測序大量DNA以獲得少量相關(guān)的序列信息。
所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)使以產(chǎn)生主要有用的序列信息的方式來設計實驗是至關(guān)重要的。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于僅富集那些目的DNA序列(靶序列)的方法。本發(fā)明的另一目的是提供用于特異性確定靶序列的序列而不需要測序(復合)樣品中存在的所有DNA的方法。
定義
本文的“組合物”是包含至少一種或多種脫氧核糖核酸分子(DNA分子)的水溶液。優(yōu)選地，所述組合物是一種復合溶液，即，包含目的DNA序列(靶序列)和其他非目的DNA序列(不需要的序列)的溶液。對于技術(shù)人員而言顯而易見的，所述不需要的序列通常比所述靶序列豐富得多，相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多的數(shù)量級。
本文中的“核糖核酸”在每一個核苷酸包括一個核糖，其碳原子編號為1'到5'。堿基被連接到1'位上，一般為腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)。腺嘌呤和鳥嘌呤是嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶是嘧啶。磷酸基團被連接到一個核糖的3'位和下一個核糖的5'位。在生理pH下所述磷酸基團均都帶有負電，使RNA成為荷電分子(聚陰離子)。所述堿基可能在胞嘧啶和鳥嘌呤之間、腺嘌呤和尿嘧啶之間以及鳥嘌呤和尿嘧啶之間形成氫鍵。但是，其它的相互作用是可能的，例如，在凸出(bulge)中的一組彼此結(jié)合的腺嘌呤堿基，或具有鳥嘌呤-腺嘌呤堿基對的GNRA四環(huán)。RNA區(qū)別于DNA的一個重要結(jié)構(gòu)特征是在其核糖的2'位上存在一個羥基基團。該官能團的存在導致螺旋采用A型幾何形狀而不是在DNA中最常觀察到的B-型。這導致形成極深且窄的大溝、陰影和寬的小溝。存在2'羥基基團的第二個后果是在RNA分子的構(gòu)象柔性區(qū)域(即，不參與形成雙螺旋的區(qū)域)，該基團能對鄰近的磷酸二酯鍵進行化學攻擊以切割所述主鏈。
有將近100個其他天然存在的經(jīng)修飾的核苷，其中假尿嘧啶核苷和帶有2'-O-甲基核糖的核苷是最常見的。
在本文，“RNA/DNA”雜交分子是當RNA鏈以反向互補的方式與DNA鏈雜交時的分子：參見圖11。
這類特異性震對RNA/DNA的雜交體的抗體也被稱為抗RNA/DNA(雜交體)的抗體。一旦這類抗體結(jié)合到RNA/DNA的雜交體，所產(chǎn)生的雜交體被稱為RNA/DNA/抗體的雜交體。
發(fā)明內(nèi)容
本文所述的方法與之前的方法的不同之處在于使用未標記的RNA探選擇性富集所述目的基因組區(qū)域(靶區(qū)域)。這樣的靶富集特別用于隨后的測序步驟，因為僅所述靶序列會被分析，從而有助于將DNA壓載物(DNA?ballast)顯著降低數(shù)個數(shù)量級。
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