[發明專利]尿激酶型纖溶酶原激活劑轉基因小鼠

有效

• 申請號: 201380022371.3
• 申請日: 2013-04-25
• 公開（公告）號: CN104334017A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 小原道法;寺社下浩一;川瀬洋介;向谷知世;大下浩樹;浜村理子
• 申請（專利權）人: 公益財團法人東京都醫學綜合研究所;中外制藥株式會社;飛氏生物株式會社
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;G01N33/15;G01N33/50;C12N15/09
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 金世煜;苗堃

技術領域

本發明涉及將含有肝特異性啟動子/增強子和在它們的控制下可驅動地被連接的編碼尿激酶型纖溶酶原激活劑的cDNA的DNA片段導入ES細胞并使用該ES細胞制作的以雜合體型導入該DNA片段的肝損傷小鼠。

背景技術

通常，在人疾病的研究中期望使用人的細胞進行實驗。特別是，在確認物種特異性的多個藥物代謝酶、宿主局限于人的病毒等所參與的疾病的研究中，需要使用人細胞，特別是人肝細胞。但是，人肝細胞的供給受到限制，維持人肝細胞的分化狀態的狀態下在體外(in?vitro)進行增殖是非常困難的。對于人肝細胞的增殖，利用生物體內的環境是比較高效的。即，嘗試通過將人肝細胞移植到對以免疫缺陷化的小鼠作為遺傳背景的小鼠導入促進小鼠肝細胞死亡的基因而成的轉基因小鼠，使人肝細胞增殖，從而大量地將小鼠肝細胞置換為人肝細胞。

病毒對人的肝臟感染所引起的肝疾病是近年來醫療領域所面對的難以治療的疾病之一。對這些感染人肝細胞的病毒具有感受性的動物種類局限于人、猩猩。為了開發針對這些病毒感染的治療藥，需要使用人的肝細胞的試驗。另外，也認為肝細胞對藥物代謝發揮重要的作用，各個藥物在人體中的代謝途徑的闡明與新的醫藥品的開發相關。但是，很多的藥物代謝酶存在物種特異性，為了闡明人體中的藥物代謝途徑，需要使用人肝細胞進行試驗。

對于丙型肝炎病毒(HCV)，據推測在日本丙型肝炎病毒的持續感染者(HCV攜帶者)有約150萬人，除此以外約40-50萬人正在接受治療，據說接受干擾素給藥的丙型慢性肝炎的患者一年有3-4萬人。最近，將病毒基因組的各種部位作為靶標的新的抗病毒藥正在開發中，但是，由于沒有可信性、再現性高的HCV用動物模型，因此其進展受到很大阻礙。這并不局限于HCV，也可以說乙型肝炎病毒(HBV)等其它病毒性肝炎也是同樣的。由于這些病毒僅以人和猩猩作為宿主，因此在使用動物的大規模抗病毒藥的開發研究中，人肝細胞與宿主肝細胞置換的小型模型動物的開發受到期待。

脂肪肝是以中性脂肪向肝臟的蓄積為原因而發病，但是，近年來通過脂肪在肝臟中蓄積而引起的肝炎，即非酒精性脂肪性肝炎(NASH：Non-alcoholic?steatohepatitis)增加，這一疾病是有可能發展為慢性肝炎、肝硬化、肝細胞癌等預后不良疾病的疾病。另一方面，指出不存在對這樣的肝疾病有效的治療藥(非專利文獻1)。在這一治療藥開發中也需要最合適的動物模型的存在。

對于以上的疾病研究，如果能夠利用置換為人肝細胞的模型動物，則有助于很多藥物開發研究。但是，對于該模型動物的制作而言，將人肝細胞移植到作為宿主的動物之后，需要人肝細胞高效地增殖，與宿主的肝細胞進行置換。

目前為止，通過使尿激酶型纖溶酶原激活劑(以下簡稱“uPA”)基因肝臟特異性表達，制作了若干對小鼠肝細胞造成損傷的轉基因小鼠，報告了若干對該小鼠移植人肝細胞的例子。報告了使用uPA基因組序列制作的uPA轉基因小鼠(非專利文獻2)、使用uPA的cDNA制作的uPA轉基因小鼠(非專利文獻3)。這些uPA轉基因小鼠均以雜合體型具有uPA基因的情況下，被移植的人肝細胞生存是困難的，因此需要以純合體型具有uPA基因。但是，為了制作以純合體型具有uPA基因的轉基因小鼠，需要至少2代，最短也需要6個月，而且相對得到的小鼠的總數，僅能以約25％的比例得到純合體型小鼠，在短時間內制作大量的以純合體型具有uPA基因的轉基因小鼠是困難的。另外，基于同樣的理由，制作與其它的轉基因小鼠的雜交系是困難的。而且，以往使用uPA基因組序列的轉基因小鼠隨著時間的經過，肝臟中導入的uPA基因發生重組，觀察到uPA基因的脫落，uPA基因脫落的小鼠細胞再生為二次肝細胞，因此即使將人肝細胞移植入雜合體型小鼠，生存也是困難的。此外，即使是純合體型，也頻繁發現由于uPA基因的脫落所致的小鼠肝細胞的再生而引起生存的人肝細胞漸漸減少的小鼠。在本領域期望能夠高效地大量生產的以及能夠容易制作與其它轉基因小鼠的雜交系的uPA轉基因小鼠。

現有技術文獻

非專利文獻

非專利文獻1:N?Engl?J?Med.346：1221-31(2002)

非專利文獻2:Cell66：245-256(1991)

非專利文獻3:BBRC377：248-252(2008)

發明內容

本發明提供雖然以雜合體型具有uPA基因，但是對來源于小鼠的肝細胞的損傷度高的肝損傷小鼠及其高效的制作方法。