[發明專利]分離方法和分離基質

有效

• 申請號: 201380021764.2
• 申請日: 2013-04-22
• 公開（公告）號: CN104245078A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: J.漢斯森;G.羅德里戈;T.E.塞德曼
• 申請（專利權）人: 通用電氣健康護理生物科學股份公司
• 主分類號: B01D15/36
• 分類號: B01D15/36;B01J20/26;B01J20/289;B01J39/26;G01N30/96
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 初明明;林森

本發明的技術領域

本發明涉及生物分子的分離，和更具體地涉及蛋白的離子交換分離。本發明還涉及適合于生物分子的分離的分離基質和涉及制備這樣的基質的方法。

發明背景

有許多情況需要從液體分離一種化合物，例如污染物或所需的分子?；陔姾?電荷的相互作用被用于許多領域以捕獲并因而分離荷電的或可荷電的化合物。

在化學和生物技術領域，目標化合物如藥物或藥物候選物通常需要從來源于生產過程的污染物質中分離。例如，通過重組宿主細胞的表達產生的蛋白藥物或藥物候選物將需要例如從宿主細胞和可能的細胞碎片、其它宿主細胞蛋白、DNA、RNA和源自發酵或細胞培養液的任何其它化合物中分離。由于其對目標化合物通用性和靈敏性，在許多當前使用的生物技術純化方案中，色譜作為至少一個步驟被包括在內。術語色譜包括一系列密切相關的分離方法，所有這些方法均基于使兩個相互不混溶的相接觸這一原理。更具體地，目標化合物被引入流動相，所述流動相與固定相接觸。然后目標化合物在其被流動相攜帶通過系統時，將經歷固定相和流動相之間的一系列相互作用。相互作用利用樣品組分的物理或化學特性的差異。

色譜中的固定相包含配體(其為能夠與目標化合物相互作用的官能團)已與之偶聯的固體載體。因此，配體將賦予載體進行分離、鑒定和/或純化感興趣的分子的能力。液相色譜方法通常按照分離化合物所利用的相互作用原理命名。例如，離子交換色譜是基于電荷-電荷的相互作用；疏水相互作用色譜(HIC)利用疏水相互作用；和親和色譜是基于特異性的生物親和性。

眾所周知，離子交換是基于荷電的目標化合物和相反荷電的色譜基質之間的可逆相互作用。最常見通過增加鹽濃度進行洗脫，但改變pH同樣是可能的。離子交換劑分為陽離子交換劑(其中荷負電的色譜基質用于吸附荷正電的目標化合物)和陰離子交換劑(其中荷正電的色譜基質用于吸附荷負電的目標化合物)。術語強離子交換劑用于在廣泛的pH間隔內荷電的離子交換劑，而弱離子交換劑在某些pH值下是可荷電的。一種通常使用的強陽離子交換劑包括磺酸根(sulphonate)配體，稱為S基團。在某些情況下，這樣的陽離子交換劑按照由官能團及其連接于載體的接頭形成的基團命名；例如SP陽離子交換劑，其中S基團通過丙基連接于載體。

離子交換劑中的荷電基團(通常稱為配體)可以不同的方式連接于載體或支持材料。幾篇出版物(US5453186、WO2008145270、US8092682、WO2012015379、EP2412433和EP2412435)描述了荷電單體如何才能接枝聚合到支持材料上，以形成其中配體存在于與支持物共價連接的懸掛接枝聚合物鏈(pendant?graft?polymer?chains)上的離子交換劑。然而，特別是在生物加工領域，對分離基質的需求不斷增加，因此存在著對進一步開發基質，特別是關于提供改進的選擇性和容量以及在堿性清洗過程中的穩定性的基質的需求。

發明概述

本發明的一個方面是提供一種具有高通量和高選擇性的分離方法。這可用如在權利要求1中定義的方法實現。一個優點是對目標蛋白的高結合容量可與例如單體的和聚集的免疫球蛋白之間的高選擇性一起獲得。另外的優點是在升高的離子強度下的高結合容量、快速的物質傳輸/結合動力學和高堿穩定性?–允許在基質必須被更換之前進行很多次循環?–?可得以實現。

本發明的另一個方面是提供具有對目標蛋白的高結合容量和高選擇性，以及高堿穩定性的分離基質。這可使用如在權利要求16中定義的基質實現。

本發明的第三個方面是提供一種制備具有對目標蛋白的高結合容量和高選擇性，以及高堿穩定性的分離基質的方法。這可采用如在權利要求29中描述的方法實現。

本發明的其它合適的實施方案在所附的權利要求書中描述。

附圖簡述

圖1顯示用烯丙基縮水甘油醚使載體上的羥基烯丙基化的反應流程。

圖2顯示用于接枝的以下單體的混合物：a)?乙烯基磺酸(VSA)和乙烯基吡咯烷酮?(VP)、?b)?3-烯丙氧基,?2-羥基-1-丙烷磺酸(APS)和乙烯基吡咯烷酮和?c)?甲基丙烯酸羥乙基酯(HEMA)和乙烯基膦酸(VPA)。

圖3顯示為除去聚集的抗體的理想(實線)選擇性曲線和不太理想的(虛線)曲線。

圖4顯示對VP-VSA原型S67-G1-A100和S67-G1-A200與參照物比較的聚集體除去選擇性曲線。

圖5顯示對VP-VSA原型S50-G1-A25和S50-G1-A50與參照物比較的聚集體除去選擇性曲線。