[發明專利]用于任何聚合酶延伸活性的靈敏的，定量的聚合酶活性檢測和用于確定活細胞的存在的方法

在審

• 申請號: 201380019842.5
• 申請日: 2013-04-12
• 公開（公告）號: CN104520438A
• 公開（公告）日: 2015-04-15
• 發明（設計）人: 肖恩·馬克·奧哈拉;丹尼爾·茲威特澤格
• 申請（專利權）人: 宙斯科技公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京市百倫律師事務所 11433
• 代理人: 周紅力;陳少麗

對相關專利的交叉引用

本申請為非-臨時申請，通過引用并入并要求申請日為2012年04月12日，美國臨時申請61/623,114的優先權。

發明背景技術

本部分和全文用到的參考文獻編號是指列于“參考文獻”部分的那些文獻。

DNA聚合酶活性對于基因組復制和生物體在所有生物區傳播是不可缺少的^(1-3)。原核生物包含5種不同類型的DNA聚合酶，但哺乳動物細胞包含15種明顯不同的細胞DNA聚合酶，但其中僅僅只有4種致力于DNA復制，而其他的則致力于DNA修復和特異的DNA合成工序，這些都實質上有助于基因完整性的保持。盡管這些酶的大部分涉及細胞核的DNA修復和復制，但發現于線粒體的DNA聚合酶γ(Polg)僅保持DNA聚合酶活性(Hum.Mol.Genet.(1July2005)14(13):1775-1783)。由于它的這種最初的特性⁽⁴⁾，體外治理DNA聚合酶活性的能力，使得它成為了分子生物學研究領域的基本工具⁽⁵⁾。超出它在研究中業已建立的重要性，體外DNA聚合酶活性測量可能在制藥和臨床事件中提供大量的有益的應用。例如，由于細菌的DNA聚合酶正在積極用于新型抗微生物劑的開發^(6，7)，能夠快速和靈敏的測定DNA聚合酶活性的分析方法是必要的。此外，喪失或獲得DNA聚合酶活性與人類疾病密切相關。例如，DNA聚合酶活性和遺傳畸變之間出現的關聯表明該酶是作為抗癌療法的靶標^(8,9)。DNA聚合酶活性的缺陷也和線粒體疾病關聯⁽¹⁰⁾。另外，DNA聚合酶活性的測定有可能作為快速和靈敏的診斷工具，在無菌的給定環境或生物基質中能夠檢測幾乎任何攜帶活性DNA聚合酶的生物體。

用于體外測量DNA聚合酶活性最常見的方法取決于放射性標記的核苷酸的摻入⁽¹¹⁾。然而，由于這種方法的固有風險以及放射性同位素相關聯的限制，使得常規使用這種DNA聚合酶測定是不受歡迎的。因此，在過去的幾十年中開發了許多非放射性體外聚合酶檢測方法。有些方法依賴于DNA聚合酶介導的單鏈結合蛋白⁽¹²⁾或PicoGreen^TM結合于雙鏈DNA^(13,14)釋放產生的熒光的測量。其他方法依賴于微板耦合及熒光標記的核苷酸檢測⁽¹⁵⁾。最近，基于分子標燈⁽¹⁶⁾和電化學的⁽¹⁷⁾DNA聚合酶測定法得到了發展。盡管成功地避免使用放射性的，但上述方法由于差的靈敏度，小的測定線性動態范圍，或者使用純化聚合酶而受限制。在過去的五十年，聚合酶活性的體外測定已成為一個重要的分子生物學工具。由于放射性核苷酸的使用，用于體外測量聚合酶活性的傳統的方法并不理想。已開發基于熒光的聚合酶分析方法，然而，它們也遭受各種限制。

發明概述

按照本發明，上述方法的各種限制已經尋找到解決方案，并且提供具有快速，高靈敏度和定量測定方法，能夠測量來自純化的聚合酶或直接從粗細胞裂解物，或亞細胞器的聚合酶延伸活性。當用純化的DNA聚合酶進行測試時，該試驗檢測小至2x10^-11U的酶(≈50分子)，同時展現出優異的線性度(R²＝0.992)。低至至少10cfu加入革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌耦合到珠磨機裂解時，也能夠檢測到內源性DNA聚合酶延伸活性，同時保持R²＝0.999。另外，按照本發明，已經證明，DNA聚合酶延伸活性是細胞生存力的指標，這也由細胞信號與活細胞計數之間可重復的強烈一致所證實。類似地，通過選擇性樣本細胞制備，完整的哺乳動物細胞也可以通過DNA聚合酶延伸分析方法來進行定量和生存力評估。總之，在給定的樣本基質中，在此描述的本發明的新方法對包含活性聚合酶的任何可能細胞或亞細胞器的靈敏的檢測表現出顯著改進。

本發明的發明人對涉及酶的模板生成和擴增(ETGA)方法具有持續的興趣。例如，美國專利申請序列號13/641480，申請日為2012年10月16日和共同轉讓的提交，描述了一種涉及這種ETGA方法及其用途的新技術。所述美國序列號為13/641480的這種ETGA方法的技術范圍在此并不作明確描述，但在此描述和要求保護的發明的完全公開可能是必要的，上述美國專利申請的全部公開內容通過引入并入本說明書。