[發明專利]來自威克漢姆西弗酵母(WICKERHAMOMYCESCIFERRII)的乙酰轉移酶

有效

• 申請號: 201380018786.3
• 申請日: 2013-03-13
• 公開（公告）號: CN104220592B
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: S·沙費爾;M·法爾維克;H·安德烈埃;T·克勒;D·沃爾夫;F·特爾費爾德;A·珀奇;E·博爾斯;C·朔爾施
• 申請（專利權）人: 贏創德固賽有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司72002
• 代理人: 王健

發明領域

本發明的主題是提供乙酰化鞘氨醇堿的新型酶。

現有技術

自從60年代開始已經使用西弗畢赤酵母(Pichia ciferrii)來生產鞘氨醇堿和鞘脂。

來自野生型株的鞘氨醇堿和鞘脂的產量一直需要提高。

鞘氨醇堿，特別是植物鞘氨醇，鞘氨醇和二氫鞘氨醇，在作為美容活性物質的各種用途中使用，以保護和護理皮膚。它們被直接摻入美容護理產品，或在化學轉化為皮膚相似的神經酰胺后摻入美容護理產品。

非常規酵母西弗畢赤酵母的特征在于，它在培養基中分泌相對大量的乙酰化鞘氨醇堿，主要是四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)和三乙酰基鞘氨醇(TriASa)。通過提取操作可以從培養肉湯中提取形成的TAPS，然后將其化學轉化為游離植物鞘氨醇和各種神經酰胺。

有效的乙酰化是將鞘氨醇堿轉運至培養基的基本要求；對微粒體部分的酶測試已經證明，與低產株相比，具有乙酰化鞘氨醇堿高產量的那些菌株(高產株)顯示顯著增加的特異性乙酰轉移酶活性(Barenholz等人，1971；Barenhoz等人，1973)。因此這種酶活性可以被鑒定為各種西弗畢赤酵母菌株有效生產乙酰化鞘氨醇堿的主要原因之一。

迄今為止，所有純化、表征和鑒定這種酶的努力均告失敗，因此所述蛋白和相應基因都是未知的。

本發明的目的是提供能夠乙酰化鞘氨醇堿的酶及其編碼序列。

發明描述

出人意料的，已經發現下文所述的酶能夠解決本發明遇到的問題。

因此本發明的主題是如權利要求所述的編碼乙酰轉移酶的分離的核酸。

本發明的另一主題是顯示本發明酶的修飾活性的重組細胞。

本發明描述的乙酰轉移酶以及編碼它們的DNA序列提供大量優點。它們可以用于生物工程化和高度特異的在各種功能團(羥基和氨基)上乙酰化指定的底物(鞘氨醇堿)。與化學乙酰化步驟相比，產生的副產品更少，因此可以將產量損失和費力的純化步驟降到最低。因此本發明具有巨大的潛力，尤其是對于需要高產品純度的應用而言。尤其在美容、食品和奢侈消費品以及藥品方面，特別高的產品純度是必需的，這樣的話本發明具有特別巨大的潛力。可以按照基本上不同的兩種方式利用本發明實現乙酰化鞘氨醇堿的生物技術生產：第一種，可以利用生物催化方法實現生產，其中在合適的反應器中通過添加乙酰轉移酶將所選鞘氨醇堿酶促乙酰化。第二種，可以通過基因工程方法(代謝工程化)使用乙酰轉移酶基因產生重組微生物菌株，其能夠在發酵過程中從簡單的碳源和氮源直接合成乙酰化鞘氨醇堿。與化工方法相比，發酵方法是更低廉并且生態上更持久。此外，它是立體特異的，而這在化學全合成中是得不到保證的。

只需利用本發明所述的乙酰轉移酶之一或其基因，可以特異性產生不完全乙酰化的鞘氨醇堿。這些可以具有特定的生物學效應，因此可用于特定應用，例如作為美容或藥物活性物質或其前體。不完全乙酰化的鞘氨醇堿只能極度費力的通過化學法制備，因此生物技術方法具有相當大的成本優勢。

除非另有說明，所述的所有百分比(％)都是質量百分比。

通過一種分離的核酸(其具有選自組[A1到G1]的序列)來提供所述問題的解決方案。

A1)Seq ID No.1所示序列，其中所述序列編碼通過轉移來自3分子的乙酰輔酶A的乙酰殘基而能夠將植物鞘氨醇轉化為三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白，

B1)無內含子的序列，其來源于A1)所示序列，并與Seq ID No.1所示序列編碼相同的蛋白或肽，

C1)編碼蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽包括Seq ID No.2所示序列并通過轉移來自3分子的乙酰輔酶A的乙酰殘基而能夠將植物鞘氨醇轉化為三乙酰基植物鞘氨醇，

D1)與組A1)到C1)之一所示序列、尤其優選組A1)所示序列具有至少70％、尤其優選至少90％、仍然更優選至少95％和最優選至少99％同一性的序列，其中所述序列編碼通過轉移來自3分子的乙酰輔酶A的乙酰殘基而能夠將植物鞘氨醇轉化為三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，

E1)與組A1)到D1)之一所示序列、尤其優選組A1)所示的序列的互補鏈雜交或考慮到遺傳密碼的簡并性將與其雜交的序列，其中所述序列編碼通過轉移來自3分子的乙酰輔酶A的乙酰殘基而能夠將植物鞘氨醇轉化為三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，