[發明專利]經修飾的亮氨酸脫氫酶

有效

• 申請號: 201380018064.8
• 申請日: 2013-03-27
• 公開（公告）號: CN104271739B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 星野亙;小玉優哉;水越利巳;田上宇乃
• 申請（專利權）人: 味之素株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N9/06;C12Q1/32
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所11105
• 代理人: 張文輝

技術領域

本發明涉及經修飾的亮氨酸脫氫酶，以及利用所述經修飾的亮氨酸脫氫酶分析總分支氨基酸的方法，等等。?

背景技術

已知有些氨基酸可成為健康狀況的指標。尤其是，支鏈氨基酸(BCAA:L-亮氨酸,L-異亮氨酸和L-纈氨酸)是在各種生物樣品或食品或飲料中大量存在重要氨基酸。所述支鏈氨基酸在活體肌肉中大量存在，已知作為蛋白質營養物的標記。已知在患有肝硬化和肝性腦病的患者中，血液中支鏈氨基酸的濃度降低，Fisher比值和BTR值之類的指標用作肝臟健康狀況的指標以及隨后觀察的指標。?

利用分析儀器的方法，包括高效液相層析(HPLC)和LC-MS方法,被廣泛地用作氨基酸分析方法。在總支鏈氨基酸的測定中，應用了利用亮氨酸脫氫酶測定BTR值的酶試劑盒(例如專利文獻1)，以及利用亮氨酸脫氫酶通過電化學法測定總支鏈氨基酸的生物傳感器(例如專利文獻2)。?

現有技術文獻?

專利文獻?

專利文獻1:Japanese?patent?application?laid-open?publication?no.JP2007-289096-A?

專利文獻2:International?Publication?no.WO2005/075970?

發明內容

本發明所要解決的技術問題?

在利用亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的濃度的測定中，有幾個方面有待改善。?

例如,總支鏈氨基酸的濃度是利用酶試劑盒中的亮氨酸脫氫酶測定的。但是，在該方法中，應用的是直到全部的底物反應了才進行測定的終點法(endpoint?method)。這是由于亮氨酸脫氫酶對L-亮氨酸,L-異亮氨酸和L-纈氨酸的底物特異性(反應速度)不同。野生型的亮氨酸脫氫酶,對于L-異亮氨酸和L-纈氨酸的底物特異性比對L-亮氨酸的底物特異性低，并且對L-異亮氨酸和L-纈氨酸的反應速度比對L-亮氨酸的反應速度慢。因此,以利用亮氨酸脫氫酶的酶試劑盒測定總支鏈氨基酸的濃度具有反應時間長的缺點。?

此外，當存在多種作為亮氨酸脫氫酶底物的氨基酸時，應用所述的生物傳感器不能單獨測定每種支鏈氨基酸的濃度。這是因為亮氨酸脫氫酶不僅與L-亮氨酸反應，其還與L-異亮氨酸和L-纈氨酸反應。在上述情況下，一般也不能測定出幾種支鏈氨基酸的總的濃度，這是因為亮氨酸脫氫酶對L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸的底物特異性(反應速度)不同。?

解決技術問題的手段?

作為本發明銳意研究的結果,本發明的發明人設想，為了快速地測定總支鏈氨基酸的濃度,通過提高亮氨酸脫氫酶對支鏈氨基酸中的每種氨基酸,特別是L-異亮氨酸和L-纈氨酸，的活性等，來改善亮氨酸脫氫酶對支鏈氨基酸的底物特異性，利用速度法(初始速度法(initial?rate?method))測定總支鏈氨基酸的濃度，由此，為改善亮氨酸脫氫酶對支鏈氨基酸的底物特異性，成功地開發出了經修飾的亮氨酸脫氫酶。本發明的發明人還成功地改善了與總支鏈氨基酸的濃度測定相關的亮氨酸脫氫酶的其他特性,并由此完成了本發明。?

因此，本發明如下：?

[1]經修飾的酶，其中的至少一個氨基酸殘基被突變，以改善選自下述的、亮氨酸脫氫酶一種或多種特性:?

(a)亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；?

(b)亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和?

(c)亮氨酸脫氫酶的熱穩定性。?

[2][1]的經修飾的酶,其中所述的突變是，亮氨酸脫氫酶氨基酸序列中的TGI基序中的異亮氨酸的取代。?

[3][2]的經修飾的酶,其中所述的TGI基序中的異亮氨酸被甲硫氨酸,?精氨酸,組氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,賴氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸,天冬酰胺,或色氨酸取代。?

[4][1]-[3]中任一項的經修飾的酶,其中所述的突變是亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中的GVI基序中的異亮氨酸的取代。?

[5][4]的經修飾的酶,其中所述的GVI基序中的異亮氨酸被苯丙氨酸,組氨酸,天冬酰胺,酪氨酸,亮氨酸,賴氨酸,谷胺酰胺,精氨酸,天冬氨酸,蘇氨酸,谷氨酸,絲氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,甘氨酸,纈氨酸,色氨酸,或甲硫氨酸取代。?