[發明專利]經修飾的亮氨酸脫氫酶

有效

• 申請號: 201380018064.8
• 申請日: 2013-03-27
• 公開（公告）號: CN104271739B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 星野亙;小玉優哉;水越利巳;田上宇乃
• 申請（專利權）人: 味之素株式會社
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N9/06;C12Q1/32
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所11105
• 代理人: 張文輝

1.經修飾的酶，其中至少一個氨基酸殘基被突變，以改善亮氨酸脫氫酶的(選自下組的)一種或多種的特性:

(a)所述亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；

(b)所述亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和

(c)所述亮氨酸脫氫酶的熱穩定性。

2.權利要求1的經修飾的酶,其中所述的突變是亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中的TGI基序中的異亮氨酸的取代。

3.權利要求2的經修飾的酶,其中所述的TGI基序中的異亮氨酸被甲硫氨酸,精氨酸,組氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,賴氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸,天冬酰胺天冬酰胺,或色氨酸取代。

4.權利要求1-3中任一項的經修飾的酶,其中所述的突變是亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中的GVI基序中的異亮氨酸的取代。

5.權利要求4的經修飾的酶,其中所述的GVI基序中的異亮氨酸被苯丙氨酸,組氨酸,天冬酰胺,酪氨酸,亮氨酸,賴氨酸,谷胺酰胺,精氨酸,天冬氨酸,蘇氨酸,谷氨酸,絲氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,甘氨酸,纈氨酸,色氨酸,或甲硫氨酸取代。

6.權利要求1-5中任一項的經修飾的酶,其中所述的亮氨酸脫氫酶來自嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillus?stearothermophilus)。

7.權利要求1-6中任一項的經修飾的酶,其是以下(1)或(2)的蛋白質:

(1)蛋白質，其包含在SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的TGI基序中的異亮氨酸和/或GVI基序中的異亮氨酸被下述(i)和/或(ii)的氨基酸殘基取代的氨基酸序列：

(i)TGI基序中的異亮氨酸

被甲硫氨酸,精氨酸,組氨酸,苯丙氨酸,亮氨酸,賴氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸,天冬酰胺,或色氨酸取代；和/或

(ii)GVI基序中的異亮氨酸

被苯丙氨酸,組氨酸,天冬酰胺,酪氨酸,亮氨酸,賴氨酸,谷胺酰胺,精氨酸,天冬氨酸,蘇氨酸,谷氨酸,絲氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,甘氨酸,纈氨酸,色氨酸,或甲硫氨酸取代；或

(2)蛋白質，其包含在SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的TGI基序中的異亮氨酸和/或GVI基序中的異亮氨酸被上述(i)和/或(ii)的氨基酸殘基取代的氨基酸序列中，具有一個或數個附加的氨基酸殘基突變的氨基酸序列,并具有選自下組的、一種或多種被改善的特性:

(a)亮氨酸脫氫酶對總支鏈氨基酸的底物特異性；

(b)亮氨酸脫氫酶對任意支鏈氨基酸的活性；和

(c)亮氨酸脫氫酶的熱穩定性。

8.一種分析總支鏈氨基酸的方法,其包括利用權利要求1-7中任一項的經修飾的酶測定試驗樣品中所包含的總支鏈氨基酸。

9.權利要求8的方法,其包括將試驗樣品與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)混合，并檢測在所述經修飾的酶的作用下由NAD⁺形成的NADH。

10.一種生產支鏈氨基酸衍生物的方法,其包括利用權利要求1-7中任一項的經修飾的酶形成來自支鏈氨基酸的衍生物。

11.編碼權利要求1-7中任一項的經修飾的酶的多核苷酸。

12.包含權利要求11的多核苷酸的表達載體。

13.包含權利要求12的表達載體的轉化體。

14.一種生產經修飾的酶的方法，該經修飾的酶中至少一個氨基酸殘基被突變以改善與總支鏈氨基酸測定相關的亮氨酸脫氫酶的特性，所述方法包括利用權利要求13的轉化體形成該經修飾的酶。

15.一種分析總支鏈氨基酸的試劑盒,其包含1-7中任一項的經修飾的酶。

16.權利要求15的分析總支鏈氨基酸的試劑盒,其還包含反應緩沖液和緩沖鹽、以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)中的至少一種。

17.一種用于分析總支鏈氨基酸的酶傳感器,其包括(a)檢測用電極，和(b)固定于或保持在所述檢測用電極上的、權利要求1-7中任一項的經修飾的酶。