[發明專利]治療血紅蛋白病的組合物和方法

在審

• 申請號: 201380017193.5
• 申請日: 2013-02-22
• 公開（公告）號: CN104284669A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 邁克爾·A·本德爾;馬克·T·格勞迪尼;巴里·L·斯托達德;亮武內
• 申請（專利權）人: 弗雷德哈欽森癌癥研究中心
• 主分類號: A61K38/00
• 分類號: A61K38/00;A61K48/00
• 代理公司: 北京同達信恒知識產權代理有限公司 11291
• 代理人: 黃志華;石磊

相關申請的交叉引用

本申請作為PCT國際專利申請于2013年2月22日提交，并要求2012年2月24日提交的美國臨時專利申請No.61/603,231的優先權，其公開內容在此以全文引用的方式并入本文。

序列表

本申請包括作為txt文件的電子形式的序列表，其標題是“序列表54428.0006WOU1_ST25”并于2013年2月22日創建并且其大小為174千字節(KB)。所述txt文件“序列表54428.0006WOU1_ST25”的內容通過引用方式并入本文。

技術領域

本公開總體涉及遺傳病的治療。更具體地，本公開提供用于改變球蛋白基因表達的基于內切核酸酶的組合物和方法，包括基于歸巢內切核酸酶和基于Cas9內切核酸酶的組合物和方法，所述組合物和方法用于治療地中海貧血、鐮狀細胞病和其它血紅蛋白病。

背景技術

血紅蛋白病，諸如地中海貧血和鐮狀細胞病，是在全球導致顯著健康負擔的非常普遍的紅細胞遺傳病。每年有超過1,300,000名患有嚴重血紅蛋白病癥的患者出生。當全球人口的5％是攜帶者時，對于臨床顯著形式的地中海貧血和鐮狀細胞病(SCD)的出生率分別是0.44個/千人和1.96個/千人。

在正常狀態下，哺乳動物紅系細胞中存在的血紅蛋白主要由兩條α樣鏈(多肽)和兩條β樣鏈的異源四聚體構成。所述β-球蛋白基因座的五個基因以簇的形式位于染色體11上。所述基因在紅系細胞中表達，并且伴隨發育在特異性位置進行；所述ε、Αγ和Gγ、及δ和β基因主要分別在胚胎期、胎兒期和產后期表達。出生時95％的β樣鏈是γ，剩下的是β。這一比率在出生后第一年逐漸轉變，這解釋了為什么限于β-球蛋白基因的表型諸如鐮狀細胞和大多數β-地中海貧血直到數月大時才表現出來。基于染色體16的α樣基因的表達不同；胚胎ζ-基因與ε的表達對應，但是成對的α-基因從胎兒期開始表達。因此，α異常在子宮內表現，潛在地伴有毀滅性的結果(如胎兒水腫)。所得的α-異源四聚體、β-異源四聚體伴隨發育表達；胚胎：Hb?Gower1(ζ2,ε2)、Hb?Gower2(α2,ε2)和Hb?Portland(ζ2,γ2)；胎兒：HbF(胎兒)(α2,γ2)以及成人：HbA2(α2,δ2)和HbA(成人)(α2,β2)。

β-地中海貧血的起因是成人β-球蛋白基因座的異常，進而導致β樣球蛋白鏈與α樣鏈的異常化學計量，造成未配對的α樣鏈沉淀。地中海貧血的嚴重程度直接與該球蛋白鏈的不平衡度相關。接下來通過數條通路介導的損傷(包括細胞蛋白和膜蛋白的氧化)的最終結果是無效的紅細胞生成、凋亡和紅細胞存活減少。已經描述了導致β-地中海貧血的超過200個突變。

鐮狀細胞病的起因是β-球蛋白基因內的單核苷酸置換，進而造成谷氨酸被纈氨酸在肽的第6位氨基酸處所置換，產生βS。與正常成人血紅蛋白(HbA)相反，攜帶該突變的血紅蛋白S(α2,βS2)被稱為HbS。在低氧濃度的情況下，HbS發生別構變化，在別構位點處其可聚合。脫氧形式的血紅蛋白在E和F螺旋之間的蛋白上呈現疏水補丁。在血紅蛋白β-鏈的第6位處的疏水性纈氨酸形成疏水補丁，所述疏水補丁可與其它血紅蛋白S分子的疏水補丁相結合，導致血紅蛋白S分子聚集并形成纖維沉淀，繼而引起紅細胞變為鐮刀狀并導致數條通路變化，這通過血管堵塞和溶血導致組織損傷。

盡管β-地中海貧血和鐮狀細胞病(SCD)分別是β-球蛋白基因座的定量病癥和定性病癥，但正常β樣球蛋白基因的表達可改善這兩種疾病。在地中海貧血中，任何對球蛋白鏈不平衡的改進都可為每個細胞提供選擇優勢，并產生臨床效益。在鐮狀細胞病中，正常或某些突變的β樣鏈的存在可通過比突變的鐮狀細胞鏈更有效地競爭α樣鏈從而減少HbS的量，通過形成阻斷Hbs(如HbF)的聚合的血紅蛋白和增加每個細胞非鐮變血紅蛋白的量，來改善臨床表型。例如，在鐮狀細胞病中，僅8％的胎兒血紅蛋白(HbF)水平可抑制HbS聚合，這導致存活率提高，而20％的HbF水平提供近乎完全的表型校正。重要的是，含有正常HbA的供體紅系細胞的后代在造血干細胞移植(HSCT)之后具有超過含HbS的內源來源的細胞的較強選擇性優勢。在骨髓中有11％供體細胞的患者具有35％的供體BFUe和73％的供體紅細胞，這導致輸血獨立性。因此，修正相對小部分的移植HSC具有臨床益處。