[發明專利]熒光觀察方法和熒光觀察設備

有效

• 申請號: 201380016595.3
• 申請日: 2013-03-25
• 公開（公告）號: CN104204779B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 藤田克昌;永井健治;齊藤健太;山中真仁;瀧本真一
• 申請（專利權）人: 奧林巴斯株式會社
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/00;G01N33/58
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司11127
• 代理人: 呂俊剛,劉久亮

技術領域

本發明涉及觀察從像例如多種熒光蛋白質這樣的熒光分子發射的熒光的熒光觀察方法，并且涉及熒光觀察設備。

背景技術

利用熒光分子觀察生物分子是在醫學或生命科學領域的標準觀察方法。已開發了熒光波長不同的各種熒光分子，并且可以利用這些熒光分子彼此結合地觀察多種生物分子。

在觀察由熒光分子發射的熒光的常規方法中，例如，存在：一種方法，其中利用可見區中的光通過單光子激發來激發熒光分子并且檢測激發光的波長的較長波長側產生的熒光(斯托克司頻移)；以及一種方法，其中利用近紅外區中的光通過多光子激發來激發熒光分子并且檢測在激發光的波長的較短波長側產生的熒光(參照例如非專利文獻1)。

在要觀察多種熒光分子的情況下，這些熒光觀察方法需要將要根據每種熒光分子的吸收光譜來選擇激發光的最佳波長，因此具有以下問題：

(問題1)在要同時觀察多種熒光分子的情況下，為了利用波長彼此不同的多種激發光同時照射試樣，需要用于多種激發光混合在同一路徑中的的光學系統，以至于光學構造復雜；

(問題2)當使用波長彼此不同的多種激發光來進行熒光觀察時，將被收集在試樣表面上的多種激發光由于當它們通過位于它們的路徑上的光學系統時發生的色差而導致它們的焦點位置隨著它們的波長變化，以至于破壞了空間重合性。結果，這個問題可導致在多種生物分子之間的交疊或生物分子的定位的分析中的偽像；以及

(問題3)雖然在順序地改變波長不同的多種激發光時針對每種熒光分子逐個執行熒光觀察，但該過程不允許同時觀察從各個熒光分子發射的熒光。具體地說，在觀察諸如活細胞這樣的活試樣中在需要同時觀察多種生物分子的運動的情況下產生不方便。

另一方面，在作為能夠解決上述問題1和問題2的現有技術文章的以下非專利文獻2中公開了利用深紫外區中的光通過單光子激發激發熒光蛋白質的方法。非專利文獻2公開了熒光分子(蛋白質)具有在深紫外區中的吸收波長帶，并且盡管這些熒光分子彼此不同，但是這些熒光分子仍在深紫外區中具有公共吸收波長帶。

結果，如果用深紫外區中的光通過單光子激發來激發熒光分子并且檢測激發光的波長的較長波長側產生的熒光(斯托克司頻移)，則能夠同時觀察到多種熒光。

然而，在其中用深紫外區中的光通過單光子激發來激發熒光分子并且檢測激發光的波長的較長波長側產生的熒光(斯托克司頻移)的情況下，具有以下問題：

(問題4)為了將深紫外區中的光收集和引導到熒光分子上，則幾乎沒有可用的光學構件，并且在光學系統的構造中存在許多限制條件，因此，難以制造滿足期望規格的光學系統。通常用作諸如光學窗和透鏡這樣的光學構件的玻璃在紫外線波長范圍內顯著地吸收系數增大并且透射率急劇地減小。結果，這種方法需要使用了諸如石英玻璃、氟化鈣和氟化鎂的特殊材料的特殊光學系統；以及

(問題5)與可見光或紅外光相比，深紫外區中的光具有較大的光能量，對活體造成大的光損傷。結果，在其中待觀察的對象是像活細胞這樣的活試樣的情況下，深紫外區中的光不適于用作用于觀察從試樣上標記有的熒光分子發射的熒光的激發光。

現有技術文獻列表

非專利文獻

非專利文獻1

Science-1990,vol.248,Winfried Denk et al.,“Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy”,Science,New Series,Vol.248,No.4951(April 6,1990),pp.73-76

非專利文獻2

Biochemistry.2004Nov 30,43,14913-14923,Turoverov et al.,“Comparative studies on the structure and stability of fluorescent proteins EGFP,zFP506,mRFP1,“dimer2”and DsRed1”

發明內容

技術問題

鑒于這些傳統問題提出本發明。本發明的目的是提供熒光觀察方法和熒光觀察設備，其可在省去了多種激發波長的情況下利用簡單的光學構造同時觀察從多種熒光分子發射的多種熒光，并且對使用熒光分子作為其熒光標簽的被觀察對象幾乎不造成損傷，并且允許利用普通玻璃作為用于熒光觀察的光學材料。

技術方案