[發明專利]含水溶性有機溶劑的脫蠟緩沖液及其使用方法

有效

• 申請號: 201380015622.5
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN104334717B
• 公開（公告）日: 2017-03-15
• 發明（設計）人: J·H·弗里蘭德;M·A·哈維
• 申請（專利權）人: 理查艾倫科學公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 余穎

相關申請的交叉參考

本申請要求2012年1月23日提交的美國專利申請號13/356,491的優先權，其內容通過引用全文納入本文。

背景

作為一種組織學研究中制備組織樣品所用的包埋介質，石蠟已經被使用了很長時間。在一些情況下，塑料樹脂也被用作包埋介質。這類包埋過程通常包括以下步驟：樣品固定(如福爾馬林固定)、脫水、清洗、石蠟浸潤或浸漬、封閉或包埋在一塊石蠟中，將石蠟塊和樣品切成薄片，將切片裝載在玻片上、去除石蠟和用于該目的(即脫蠟或脫石蠟)的溶劑、以及在鏡檢前對切片進行染色。包埋介質的主要目的是使樣品在天然狀態下被切片和裝載。石蠟包埋的優勢在于可在染色前將蠟溶解使之與樣品分離，從而使染色時切片為裸露組織的形式并且避免了與難以去除的基于樹脂的包埋材料的存在相關的額外困難。

最近對于石蠟包埋組合物的改進拓寬了其實用性，同時保留了其與下游樣品制備和分析的相容性。因此，對固定后石蠟包埋材料切片的脫蠟仍是一種廣泛使用的方法，尤其是在免疫診斷目的的醫院組織病理學實驗室中。

一種通常使用的脫蠟方法涉及在有機溶劑中溶解包埋的石蠟。例如，目前通常在實驗方案中使用二甲苯(一種可燃、有揮發性和毒性的有機溶劑)以溶解石蠟，實現對樣品切片的脫蠟。通常，將裝載在顯微鏡玻片上的樣品浸入二甲苯浴中直至石蠟溶解。

另一種常用于脫蠟的方法涉及在含水性緩沖溶液的熱浴中熔解并去除包埋的石蠟。使用熱緩沖溶液的額外優勢在于其可通過一種被稱作熱誘導表位修復(HIER)的過程進行抗原修復。HIER是一種常在免疫組化(IHC)或原位雜交(ISH)前使用的預處理過程，用于通過對裝載在玻片上的樣品材料中所含靶蛋白的分子構象進行熱誘導修飾以改善染色。通常該修飾過程是必需的，因為雖然醛基固定劑(如福爾馬林)能夠很好地保存細胞形態，但它們也會引起蛋白交聯，導致一些蛋白表位無法結合互補的抗體。HIER通常與酶消化聯用，作為改善IHC/ISH染色反應中多種抗原反應性的方法。

現有的被設計用來在IHC/ISH前同時對玻片脫蠟并進行HIER的緩沖液配方利用了低濃度的表面活性劑和其他乳化劑以破碎石蠟。HIER步驟中玻片被置于高溫(如70至100℃)下，使石蠟熔化且表面活性劑溫和地將石蠟運送至緩沖液表面。然而，已知的緩沖液配方和方法的性能有限，有時會造成石蠟拖尾、玻片重新涂覆和不一致的染色結果。

相應地，需要能夠在免疫組化或其他診斷分析前有效地去除樣品中的石蠟或改良的石蠟基包埋材料的脫蠟組合物和方法，同時最小化對使用者的危險，與自動系統相容且保持與下游分析的相容性。需要不存在毒性或致癌性或毒性或致癌性有限、不產生或產生最少量的氣味、能夠降低有毒溶劑的使用量，使有毒廢物最少和/或能夠降低腐蝕性和可燃性的脫蠟組合物和方法。

發明內容

本發明公開了含水溶性有機溶劑的脫蠟緩沖液及其使用方法以及包含脫蠟緩沖液的試劑盒。本文所述脫蠟緩沖液可用于在高溫下的水性緩沖溶液中快速并有效地去除裝載在玻片上的組織切片中的包埋的石蠟，同時無需擔心玻片上石蠟的再沉積。此外，本文所述脫蠟緩沖液可在單個步驟用于脫蠟和HIER，能夠大幅減少實驗方案的時間并降低樣品損失或破壞的風險。

在一個實施方式中，一種脫蠟緩沖液包括緩沖劑、沸點高于80℃且在水中的溶解度至少為20體積百分比(vol％)的有機溶劑和水。所述脫蠟緩沖液的工作溶液可包括大于95vol％的水。在一個實施方式中，可使用濃縮脫蠟緩沖劑，通過用水稀釋濃縮液以制備脫蠟緩沖液工作溶液。

在一個方面，所述脫蠟緩沖液能夠在高溫下在水性溶液中溶解熔解后的包埋石蠟且熔解后的石蠟在冷卻后不會發生再固化。同樣，所述脫蠟緩沖液能夠降低石蠟的熔點，這可以大幅減少實驗方案的時間。人們認為該活性是由于水溶性有機溶劑的作用。也就是說，由于溶劑化學性質的雙重性，人們認為該溶劑能夠在水性溶液中破壞氫鍵，并在水中溶解有機分子(如石蠟)。

通過以下描述和所附權利要求書或者通過學習下文中所述的本發明的實踐，可以更充分地理解本發明的這些和其他目的及特征。

發明詳述

I.引言