[發明專利]通過新一代測序進行基因分型

在審

• 申請號: 201380013610.9
• 申請日: 2013-01-11
• 公開（公告）號: CN104334739A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 帕特里克·S·施納布爾;劉三震;吳薇
• 申請（專利權）人: DATA生物有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 杜艷玲;梁謀

本申請要求2012年1月13日提交的美國臨時專利申請61/586,596的優先權，其以全文引用的方式并入本文中。

關于聯邦資助的研究或開發的聲明

本發明是在國家科學基金會授予的資助號IOS-1027527、IOS-0820610、IOS-0910642和DEB0919348的政府支持下完成的。政府對本發明享有某些權利。

技術領域

本文提供與基因分型有關的技術并且特別但不僅僅是通過基因組測序對一種或多種受試者進行基因分型的方法。

發明背景

新一代測序使得研究人員能夠以較低成本獲得大量的數據并因此對于深入地對任何物種的個體進行基因分型提供巨大的機會(Lai等，″Genome-wide?patterns?of?genetic?variation?among?elite?maize?inbred?lines″2010，Nat?Genet?42：1027-1030)。近來，開發了若干種通過測序進行基因分型(GBS)的方法以同時對數百名個體進行基因分型(Andolfatto等，″Multiplexed?shotgun?genotyping?for?rapid?and?efficient?genetic?mapping″2011，Genome?Res?21：610-17；Baird等，″Rapid?SNP?discovery?and?genetic?mapping?using?sequenced?RAD?markers″?2008，PLoS?One?3：e3376；Elshire等，″A?Robust，Simple?Gneotyping-by-Sequencing(GBS)Approach?for?High?Diversity?Species″2011?PLoS?One?6：e19379)。

最通常使用必須預先發現和驗證的預定義的SNP標記進行常規的基因分型；這些標記通常具群體特異性。這些SNP典型地通過雜交或通過基于單獨的SNP特異性PCR的測定法檢測。相比之下，GBS技術使得能夠相比于基于PCR的測定法(例如，SNP加上小的插入和/或缺失，例如，“indel”)檢測更寬泛范圍的多態性。GBS技術無需預先發現和驗證多態性。因此，GBS可以用于任何多態物種和任何分離群體中。

然而，常規的GBS方法共有至少兩個缺點。首先，常規方法使用雙鏈銜接子并且因此相關方法需要嚴格控制銜接子連接中的模板：銜接子濃度比。結果是，需要精確定量的高質量輸入DNA作為起始物質(參見例如Elshire等)。其次，這些方法調查幾十萬或更多個位點并因此需要眾多的測序讀段以對每個樣本中的每個位點產生足夠的覆蓋。

發明內容

因此，本文提供與GBS有關的技術。特別是，提供使用單鏈寡核苷酸代替常規的雙鏈銜接子用于連接反應的本技術的實施方案(參見例如Liu等，“DLA-based?strategies?for?cloning?insertion?mutants：cloning?the?g14?locus?of?maize?using?Mu?transposon?tagged?alleles”2009?Genetics?183：1215-25，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)。例如，單鏈寡核苷酸進行自連接的程度不如雙鏈銜接子并且因此模板：銜接子比遠遠不如在常規方法中關鍵。

此外，在本技術的一些實施方案中，使用單鏈寡核苷酸消化和連接的方法以對核酸(例如，DNA)進行“條形碼標記”或標簽標記。因此，在一些實施方案中，在維持每個DNA的條形碼中的源信息的同時，將眾多(例如，數百個、數千個、數萬個、數百萬個等)條形碼標記DNA組合于單個多重化樣本中以進行分析。在分析之后，將數據解卷積以獲得與每個條形碼標記DNA相關的數據。