[發明專利]用于體細胞核重編程的先天免疫激活

無效

• 申請號: 201380011433.0
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN104781396A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: J·P·庫克;李知垠;N·賽耶德
• 申請（專利權）人: 小利蘭·斯坦福大學托管委員會
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 楊昀

政府權利

本發明是在政府支持下根據國家衛生研究所授予的合同HL100397和HL103400完成的。政府對本發明享有某些權利。

發明背景

Yamanaka和同事進行的開創性研究顯示某些轉錄因子的異位表達可能會誘導體細胞的多能性。這些誘導性多能干細胞(iPSC)自我更新并且分化成多種細胞類型，從而使其成為用于疾病和患者特定性再生醫學療法的一種有吸引力的選擇。它們已被用于成功地模型化人類疾病并且具有極大的用于藥物篩選和患者特定性細胞療法的潛能。此外，從患病細胞產生的iPSC可充當適用于研究疾病機制和潛在療法的工具。然而，仍應對有關體細胞重編程為iPSC的潛在機制有更多了解，并且要關注在沒有機制性深入理解的情況下的潛在臨床應用。

用于重編程為多能細胞的因子(RF)組包括Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog。Oct3/4和Sox2是在胚胎干(ES)細胞中保持多能性的轉錄因子，而Klf4和c-Myc被認為是提高iPSC產生效率的轉錄因子。據信轉錄因子c-Myc修飾染色質結構以允許Oct3/4和Sox2較有效地接近為重編程所必需的基因，而Klf4通過Oct3/4和Sox2增強某些基因的激活。Nanog(像Oct3/4和Sox2一樣)是在ES細胞中保持多能性的轉錄因子，而Lin28是被認為影響在分化期間特異性mRNA的轉譯或穩定性的mRNA結合蛋白。最近，已證實Oct3/4和Sox2的逆轉錄病毒表達與丙戊酸、染色質去穩定劑和組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的共施用一起足以使成纖維細胞重編程為iPSC。

為從體細胞產生iPSC，已使用病毒載體或質粒來過表達這些重編程因子的一些組合。然而，這些方法產生低重編程效率并且未能提供對重編程過程的精確控制。此外，這些用于核重編程的方法固有地引起關于由DNA整合所引起的潛在致瘤性和基因沉默突變的擔憂。因逆轉錄病毒感染造成的外來DNA整合到宿主基因組中引起對外來DNA可使必需基因沉默或誘導這些基因調節異常的擔憂。雖然Cre-LoxP位點基因遞送或PiggyBac轉座子途徑已用于在基因遞送之后從宿主基因組上去除外來DNA，但沒有一種策略消除誘變的危險，因為其留下小的殘余外來DNA插入物。

作為基因修飾的替代方案，已產生用于無整合核重編程的細胞穿透蛋白(CPP)，其中重編程因子融合到為蛋白質膜運輸到核中而提供的結構域中。已通過使用純化重組蛋白在鼠胚胎成纖維細胞中實現成功重編程為多能細胞。盡管已使用來自胚胎干細胞(ESC)以及過表達四種轉錄因子的HEK293細胞的細胞提取物重編程人類細胞，但尚未使用純化CPP重編程人類細胞。并且甚至在小鼠細胞情況下，使用CPP的重編程效率(約0.001％)比使用逆轉錄病毒載體實現的重編程效率(0.1％-1％)低大于10倍。

用于iPSC產生或轉分化成不同體細胞類型的基于CPP和/或小分子的途徑避免了關于外來DNA整合的所有擔憂，并且提供對濃度、時間和因子刺激順序的較大控制，然而此類方法在實際操作中仍存在重大問題。本發明解決了這個問題。

發明概述

提供用于使用非整合方法有效產生誘導性多能細胞或轉分化細胞的組合物和方法。在本發明的方法中，需要重編程為多能細胞或轉分化的體細胞與有效劑量的toll樣受體(TLR)激動劑接觸，所述TLR包括但不限于TLR3。接觸步驟可在細胞與非整合重編程因子接觸之前、與其同時或在其之后進行，通常同時進行。非整合重編程因子是核作用多肽或改變轉錄的小分子，并且其可誘導靶細胞重編程。在一些實施方案中，重編程因子是融合到多肽穿透結構域中的多肽，例如如本領域中已知的九精氨酸、tat等。在一些實施方案中，重編程因子是Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog中的一者或多者。

在一些實施方案中，提供重編程細胞群，其中初始體細胞群重編程為誘導性多能或轉分化細胞群。此類細胞在本領域中已知的各種方法(包括藥物篩選、自體或異體移植治療性細胞施用等)中獲得應用。重編程細胞群因不存在整合遺傳因子而提供優勢。