[發(fā)明專利]用于傳染性皮下及造血器官壞死病毒的實(shí)時(shí)病毒檢測(cè)方法和試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201380011125.8
• 申請(qǐng)日: 2013-01-15
• 公開（公告）號(hào): CN104204231A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇巴·A/P·巴哈蘇;諾芬娜·雅士明·賓蒂奧斯曼;華朋·楚;徒雷·昆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 馬來亞大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70
• 代理公司: 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;彭愿潔

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)蝦(shrimps)中由傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)引起的病毒感染的方法。更具體地，本發(fā)明提供一種高通量實(shí)時(shí)病毒性檢測(cè)方法，用于篩選和鑒定蝦中IHHNV，以及一種快速檢測(cè)系統(tǒng)及其試劑盒。這能夠控制蝦中IHHNV的流行，從而增強(qiáng)蝦類養(yǎng)殖業(yè)中的育種計(jì)劃，特別是對(duì)于巨型淡水蝦——羅氏沼蝦(Macrobrachium?rosenbergii)。

背景技術(shù)

巨型淡水蝦——羅氏沼蝦，是世界各地最常用的商業(yè)養(yǎng)殖蝦種。作為富含蛋白質(zhì)的好食物來源，這種蝦被稱為高價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品之一。此外，作為一種有價(jià)值的出口產(chǎn)品，它具有重要商業(yè)價(jià)值。然而，蝦養(yǎng)殖中的管理不善常引起廣泛的病毒感染，這也已成為羅氏沼蝦蝦養(yǎng)殖計(jì)劃的主要限制因素。在更嚴(yán)重的程度上，病毒感染導(dǎo)致急性流行病，頻繁地伴隨蝦種群的爆發(fā)性死亡，導(dǎo)致商業(yè)水產(chǎn)業(yè)實(shí)際經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)有價(jià)值的野生種群延續(xù)造成威脅。

IHHNV感染是蝦病害的主要原因之一，尤其在羅氏沼蝦中，它已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為最顯著的水產(chǎn)業(yè)病害之一。IHHNV感染也出現(xiàn)在馬來西亞的淡水蝦——羅氏沼蝦中，并在2009年有所報(bào)道。最初通過常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)并使用標(biāo)準(zhǔn)的OIE列出的引物擴(kuò)增病毒基因組內(nèi)389bp的特異性區(qū)域來檢測(cè)這種感染(OIE,2003)。然而，這種建議的引物的使用伴隨著現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)程序顯示出在PCR結(jié)果中的非特異性條帶。這可能是由發(fā)生在IHHNV病毒基因組中的突變引起的，或由樣品中病毒載量水平低引起的。因此，羅氏沼蝦蝦養(yǎng)殖中的一個(gè)主要目標(biāo)集中于更特異性引物和更有效方法的研究和開發(fā)，以獲得對(duì)IHHNV的更精確和可靠的檢測(cè)結(jié)果。

現(xiàn)有技術(shù)中有幾個(gè)專利技術(shù)涉及用于檢測(cè)IHHNV的方法、系統(tǒng)或試劑盒。在這些現(xiàn)有技術(shù)，美國(guó)專利第2008293037號(hào)披露了用于診斷檢測(cè)IHHNV的引物序列。根據(jù)該文獻(xiàn)，分離的引物基于IHHNV基因組的一個(gè)新的部分，并且可以在引物引導(dǎo)的擴(kuò)增(primer-directed?amplification)或核酸雜交測(cè)定法中使用。這種方法意在檢測(cè)IHHNV的存在并定量化該病毒。然而，該專利技術(shù)僅使用簡(jiǎn)單的擴(kuò)增和雜交方法，并沒有公開任何與其預(yù)定程序配套的特異性PCR引物以提供快速且特異性的檢測(cè)結(jié)果。

現(xiàn)有技術(shù)中也公開了PCR擴(kuò)增檢測(cè)IHHNV或有關(guān)蝦病毒的其它例子。馬來西亞專利申請(qǐng)?zhí)朠I2011002235公開了一種通過巢式PCR技術(shù)檢測(cè)生物樣品中IHHNV的方法。此方法包括使用第一引物組通過第一PCR擴(kuò)增生物樣品中病毒的保守片段的步驟；以及在第二PCR中使擴(kuò)增的保守片段與第二引物組接觸的步驟。然而，這種巢式PCR方法對(duì)于檢測(cè)發(fā)展階段的IHHNV的存在可能并不足夠敏感。

此外，中國(guó)專利第1786711號(hào)也提供了一種用于檢測(cè)IHHNV的熒光定量(FQ)-PCT方法和試劑盒，提供正向引物和反向引物以及熒光探針。這種熒光探針使用羅丹明(TAM)作為熒光基團(tuán)、四甲基羅丹明(TAMRA)作為猝滅劑。然而，該文獻(xiàn)沒有披露所應(yīng)用的IHHNV引物的來源。該文獻(xiàn)也沒有披露這種方法和試劑盒的效率，以及是否不同種的IHHNV可以在其不同發(fā)展階段進(jìn)行定量檢測(cè)。

IHHNV是20至22nm、二十面體、無包膜病毒，在CsCl中的密度為1.40g·ml^-1，并含有單鏈線性DNA基因組。這種病毒能引起嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲延，在商業(yè)淡水蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中導(dǎo)致嚴(yán)重阻礙。它可以持續(xù)存在于健康攜帶者中，并通過垂直傳播傳遞給其子代，以及通過水平傳播傳遞給其它種群。由于野生或池塘養(yǎng)殖的種系可能是無癥狀個(gè)體，它們不可避免地在蝦養(yǎng)殖中造成生物安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要開發(fā)對(duì)病毒病原體的健康攜帶者進(jìn)行IHHNV檢測(cè)的方法。此外，對(duì)感染的對(duì)蝦中病毒載量的定量允許養(yǎng)殖蝦病的監(jiān)控，因此可以在疾病爆發(fā)前采取有效措施。

現(xiàn)有技術(shù)顯示，現(xiàn)有的基于PCR的IHHNV檢測(cè)不能給出特異性且可靠的結(jié)果，以用于靈敏且準(zhǔn)確地檢測(cè)羅氏沼蝦中的IHHNV，特別是在其各種發(fā)展階段。此外，大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)中可用的檢測(cè)方法和系統(tǒng)集中于受感染的蝦而不是健康攜帶者。因此，本發(fā)明期望提供一種特別設(shè)計(jì)的方法、系統(tǒng)或試劑盒，用于實(shí)時(shí)定量檢測(cè)IHHNV，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于，提供一種用于蝦樣品尤其是羅氏沼蝦中的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)IHHNV的方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種診斷試劑盒，用于IHHNV的快速檢測(cè)，其基于專門設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。