[發明專利]一種測定樣品中抗原含量的方法

有效

• 申請號: 201380003753.1
• 申請日: 2013-01-03
• 公開（公告）號: CN103959064A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 張建棣
• 申請（專利權）人: 煙臺載通生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

本專利要求基于美國臨時專利申請，61/583,624，申請日期：2012年1月6號；美國專利申請13/459192，現為美國專利ＵＳ8293487，申請日期，2012年4月29號；美國專利繼續申請，13/656715，申請日期，2012年10月21號，以及國際專利申請ＰＣＴ/ＵＳ2013/020138，出版號碼，ＷＯ2013/103712的申請優先權。

技術領域

本發明涉及對包括化合物、多肽、蛋白質、RNA、DNA、細胞(在原位釋放的蛋白質)、或病毒顆粒(在原位釋放的蛋白質)等抗原的免疫檢測處理。更重要的是，本發明包括，但不局限于免疫印跡分析、斑點印跡分析以及酶聯免疫吸附測定法等免疫檢測方法，提供了相應的創新，使之更簡單，可定量測量，從而達到其在多孔板格式的應用的目的，以及實現蛋白質分析的自動化。

背景技術

蛋白質分析是現代生物學研究的重要基礎。這項技術基于抗原-抗體相互作用的原理，來測量目標抗原在各種醫療或實驗條件下的表達水平。抗原指當進入人體時，能夠觸發免疫系統產生特異抗體的外來分子。抗體由于其針對特定抗原的高特異性，成為臨床、制藥和生物醫學研究中一個有力的工具。抗原包括，但不限于，一種化合物、多肽、蛋白質、RNA分子、DNA分子、細胞(在原位釋放的蛋白質)或病毒顆粒(在原位釋放的蛋白質)。完整或部分抗原分子，可被引入到包括驢、山羊、兔子等宿主動物體內，產生大量針對目標抗原的抗體。此外，導入的抗原或抗原的一部分，可能具有一個或幾個抗原決定簇，因此，由于抗原決定簇數目的不同，宿主體內可能產生一個或多個針對目標抗原的特異性抗體。

一個典型的免疫檢測過程可以分為三個主要步驟，其中包括：(i)，點樣，將含有目標抗原的樣品首先轉移到膜上，如硝酸纖維素膜，PVDF膜或像具有結合蛋白質能力的多孔板一類的固相載體；(ⅱ)，阻塞/處理/洗滌步驟。這一過程又包括多個子步驟。首先，(a)點樣后的膜被封閉緩沖液處理來避免抗體非特異性結合到膜上，然后在(b)中，膜和含有抗體的封閉緩沖液一起培育，從而在膜上形成抗原抗體復合物。而沒有機會和目標抗原結合的抗體在這一過程中被洗掉。在這一步驟中，使用的抗體有的被標記酶直接標記，有的通過被標記酶標記的第二抗體間接標記。(iii)樣品的檢測，通過在膜上與抗體耦合的標記酶的酶促反應，與膜結合的免疫復合物的數量或者質量及其他相關信息得到檢驗。在斑點印跡分析和免疫印跡分析中，免疫檢測分析的最終結果可以進一步通過光密度分析的方法間接進行量化處理。

在這個廣義的檢測過程中，每個步驟在實踐中都可能有所變化。例如，在步驟(i)中，點樣的方法有多種。這些方法包括斑點印跡分析中的直接點樣，免疫印跡分析中樣品通過凝膠轉移，和酶聯免疫吸附法中樣品涂層的方法。在步驟(ii)，各種處理方法和不同成分的緩沖阻塞液在實踐中被采用以達到最大限度地保存結合在膜上的免疫復合物的目的，并同時清除掉直接結合在膜上的抗體。在大多數情況下，標記酶并不被直接用來標記第一抗體。被標記酶標記的第二抗體通過與在膜表面上與目標抗原結合的第一抗體產生抗原抗體反應來間接標記第一抗體。在步驟(iii)中，除了標記酶標記，其他方法也被用于標記抗體，從而導致了不同的檢測方法。例如，產生出深淺不同的顏色變化通過目視加以比較；或者產生化學發光信號，通過發光讀數儀或X射線膠片進行檢測。在檢測過程中抗體也可以通過熒光加以標記，而形成的產物在特定的波長通過多孔板讀數儀進行定量化分析。

當然，這個對廣義的免疫檢測過程的描述僅僅是被用來說明常規免疫檢測分析的基本原理。它不可能涵蓋了在這一過程中各種不同的方式方法。因而有所遺漏則在所難免。但是這些沒有被包括進去的方式方法在原理上同這個廣義的免疫檢測過程是一致的。

斑點印跡分析則是上述免疫檢測過程的一個典型應用。這種方法因為直接在膜上點樣形成一個斑點而得名。這種方法雖然簡單、快速，但由于缺乏特異性，導致其在生物醫學，臨床和制藥研究中的應用受到了限制。在多數的情況下，用于免疫檢測反應的抗體由于種種原因而與多個抗原產生抗原抗體反應。因此，在斑點免疫分析中的標記酶的酶促反應難以可靠地反映目標抗原在待測樣品中的含量。正因為這個原因，無論是免疫印跡分析還是酶聯免疫吸附法都由于其提高的特異性而在蛋白質分析中得到廣泛應用。