[發明專利]刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型及構建方法及應用

有效

• 申請號: 201310756418.0
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103729576B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 盧文玉;王曉陽;張傳波;薛超友
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G06F19/12
• 分類號: G06F19/12;G06F19/18
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于微生物菌株代謝工程分子改造技術領域，特別涉及刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型及構建方法及應用。?

技術背景

多殺菌素是一種大環內酯類抗生素，由刺糖多孢菌經有氧發酵產生。由于多殺菌素獨特的化學結構和作用機制，它可以有效防治小菜蛾、甜菜夜蛾等多種鱗翅目害蟲，同時對哺乳動物、鳥類等沒有毒性(ACS?symposium?series.Discovery,isolation,and?structure?elucidation?of?a?family?of?structurally?unique,fermentation-derived?tetracyclic?macrolides.1992)。多殺菌素也因此被認為是繼阿維菌素之后最為有效的生物殺蟲劑，成為新型生物農藥研發的熱點。由于該化合物兼具化學農藥的速效性和生物農藥的安全性、低殘留等優點，繼1999獲得美國“總統綠色化學品挑戰獎”后，2008年其衍生物再一次獲得該獎(The?Journal?of?antibiotics.The?spinosyn?family?of?insecticides:realizing?the?potential?of?natural?products?research.2010)。?

由于野生型菌刺糖多孢菌菌株產多殺菌素能力弱，因此自其被發現以來，科學家采取多種手段對原始菌株進行改良。目前，研究人員對多殺菌素發酵單位提高所做的努力主要集中在傳統的理化性質誘變，利用基因工程手段對多殺菌素合成途徑基因進行局部敲除或過表達改造。多殺菌素作為刺糖多孢菌的一種次級代謝物，其合成途徑復雜，局部水平的改造具有一定的盲目性，而且其改造結果也難以滿足生產需求。?

近幾年內，隨著高通量測序技術的發展，測序成本的降低，越來越多的物種全基因組被測序。如何利用如此龐大的基因組數據成為人們的研究熱點。基因組尺度網絡模型，以基因組注釋信息為基礎，提供了一個在整體水平上考察細胞代謝的理想視角(Current?opinion?in?biotechnology.Recent?advances?in?reconstruction?and?applications?of?genome-scale?metabolic?models.2011)。基因組尺度網絡模型可以從整體上反應系統對外界擾動的反應，揭示與該擾動相關的機理，確定不同表型的潛在原因，是系統生物學研究的重要工具。魯棒性分析作為一種分析方法，它能反映目標反應對某特定反應的敏感性。?

胞內還原力水平對次級代謝物合成具有重要影響，NADPH的再生水平是限制生物轉化效率關鍵因素，目前，增加胞內NADPH水平主要通過以下三條途：磷酸戊糖途徑；三羧酸循環途徑；轉氫酶途徑。對轉氫酶的改造，可以調節胞內輔因子的平衡，提高目標產物的產量。在大腸中過表達pntAB，可以使苯乙酮到(R)-苯基乙醇l的轉化效率提高3.5倍(Biotechnology?letters.Improved?synthesis?of?chiral?alcohols?with?Escherichia?coli??cells?co-expressing?pyridine?nucleotide?transhydrogenase,NADP⁺-dependent?alcohol?dehydrogenase?and?NAD+-dependent?formate?dehydrogenase.2004)在谷氨酸棒狀桿菌中過表達PntAB可以顯著提高L-l賴氨酸的產量(Applied?microbiology?and?biotechnology.Expression?of?the?Escherichia?coli?pntAB?genes?encoding?a?membrane-bound?transhydrogenase?in?Corynebacterium?glutamicum?improves?L-lysine?formation.2007).Bastian(Metabolic?engineering.Engineered?ketol-acid?reductoisomerase?and?alcohol?dehydrogenase?enable?anaerobic2-methylpropan-1-ol?production?at?theoretical?yield?in?Escherichia?coli.2011)在異丙醇生產過程中通過過表達PntAB解決了輔因子不平衡問題，使異丙醇的產量提高了6.5倍。?