[發明專利]刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型及構建方法及應用

有效

• 申請號: 201310756418.0
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103729576B
• 公開（公告）日: 2017-01-25
• 發明（設計）人: 盧文玉;王曉陽;張傳波;薛超友
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G06F19/12
• 分類號: G06F19/12;G06F19/18
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所12201
• 代理人: 陸藝

1.一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型的構建方法，其特征包括如下步驟：

根據KEGG及NCBI數據庫中刺糖多孢菌基因組序列的注釋信息，添加多殺菌素生物合成的特征反應和菌體合成反應，并對網絡反應進行手動精煉，獲得刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型。

2.權利要求1的方法構建的刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型。

3.一種刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型在預測與提高多殺菌素產量相關基因靶點的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征是包括如下步驟：

1）通過對刺糖多孢菌基因組尺度代謝網絡模型進行分析，利用魯棒性分析方法，確定SEQ?IDNO.3所示的轉氫酶PntAB對多殺菌素生物合成的影響；

2）根據NCBI上的轉氫酶基因序列設計SEQ?IDNO.1所示的上游引物和SEQ?IDNO.2所示的下游引物,以刺糖多孢菌基因組為模板,PCR擴增轉氫酶pntAB基因，利用XbaI和NdeI雙酶切，將轉氫酶pntAB基因插入到經相同酶切含鏈霉菌強啟動子ermE*質粒pOJ260上，得到質粒pOJ261，轉化大腸桿菌DH5а，提取質粒后轉入大腸桿菌ET12567，利用結合轉移的方法轉入刺糖多孢菌（Saccharopolyspora?spinosa）ATCC49460中，以50μg/mL的安普霉素篩選得到刺糖多孢菌基因工程菌SP-PNT；

含鏈霉菌強啟動子ermE*質粒pOJ260的構建步驟為：將pIB139質粒用HindIII?and?XbaI雙酶切，插入質粒pOJ260中，獲得含鏈霉菌強啟動子ermE*質粒pOJ260；

表達載體pIB139，構建方法參考J?MolMicrobiol?Biotechnol4(4):417-426，由pSET152中插入ermE*強啟動子構成。

3）將刺糖多孢基因工程菌SP-PNT在發酵培養基中進行發酵，產量比野生型提高，證明轉氫酶pntAB基因對多殺菌素生物合成有影響；

所述發酵培養基配方為：葡萄糖77g/L，棉籽餅粉28g/L，胨化牛奶20g/L，玉米漿膏14.5g/L，油酸甲酯40g/L，CaCO₃5g/L，鼠李糖1g/L，余量為水，pH=7.0。