[發明專利]一種多殺菌素的補料發酵及分離純化方法

無效

• 申請號: 201310756417.6
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103725734A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 盧文玉;王美玲;尹靜;趙方龍
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C07H17/08;C07H1/08;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于發酵工程技術領域，具體涉及多殺菌素的發酵及分離純化方法。

背景技術

多殺菌素(spinosad)是由土壤放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosad)產生的次級代謝產物，屬于大環內酯類化合物，主要有效成分為多殺菌素A和D，分別占所有組分的85-90%和10-15%。多殺菌素作為一種新型的微生物源殺蟲劑，具有毒力高、殺蟲譜廣、作用方式獨特、殘留低、環境友好、對人畜無害等特性，應用前景十分廣闊。

目前，制約多殺菌素實現產業化和廣泛應用的主要問題在于生產成本高，發酵工藝復雜，發酵效能低。優化培養條件及分離純化工藝，從而提高發酵效價、降低生產成本是目前促進多殺菌素產業化的研究重點。

研究表明，植物油可以提供抗生素合成的前體和能量，對抗生素的合成有促進作用。發酵后期由于碳源或溶氧的限制，菌體自溶，pH上升。在發酵中后期補加混合油脂，油脂分解產生脂肪酸中和OH-，使得發酵中后期的pH基本穩定在7左右。恒定的pH環境及大量的前體物質會大大促進多殺菌素的合成，在發酵過程中補加油脂是過程補料的重要內容。對于多殺菌素的分離純化，據國內文獻報道，王琨等用DM11樹脂在pH為9.5時吸附多殺菌素，并用丙酮解吸，回收率高達85.8%。夏立秋等利用萃取與反萃取相結合的技術路線進行多殺菌素的提取，總收率達到80%以上。中國專利CN101560231中公開了一種大孔樹脂梯度洗脫的提取工藝，收率達到68.2%，純度達到95.3%。但是，目前樹脂吸附法的工藝研究尚不完善，已有的樹脂吸附法的報道中，普遍存在泄漏率較高、產品收率及純度較低的問題。本領域迫切需要深入研究并優化多殺菌素的發酵工藝和分離純化工藝，有效提高多殺菌素產量并降低生產成本。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種多殺菌素的補料發酵方法。

本發明的第二個目的是提供一種多殺菌素的補料發酵液的分離純化方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種多殺菌素的補料發酵方法，包括如下步驟：

（1）將能提高多殺菌素產量的基因工程菌LU104經斜面培養、種子培養，得到種子液；

（2）將種子液以接種量5%-15%的比例接種到發酵培養基中，于30℃、200-250rpm發酵168-288h，在發酵0-140h時，一次性補加混合油脂和玉米漿，使混合油脂的質量濃度為1-4%，使玉米漿質量濃度為0.5-3%，再在141-150h第二次補加玉米漿，使第二次補加玉米漿的質量濃度為0.5-3%，所述混合油脂是由按質量比為0.5-4:1的油酸甲酯和植物油組成，發酵結束，得到補料發酵液。

優選的是發酵培養基組份按g/L計：葡萄糖50-70、麥芽糖5-20、豆油15-30、棉籽蛋白20-30、豆粉5-15、酵母膏10-25，K₂HPO₄0.5-2，NaCl0.5-2，MgSO₄2-3，CaCO₃5-7，余量為水，pH=7.5-8.0。

步驟（2）優選為：將種子液以接種量10%的比例接種到發酵培養基中，于30℃、220rpm發酵240h，得到補料發酵液；在發酵96h時，一次性補加混合油脂和玉米漿，使混合油脂的質量濃度為3%，使玉米漿質量濃度為1%，再在144h第二次補加玉米漿，使第二次補加玉米漿的質量濃度為1%，所述混合油脂是由按質量比為2:1的油酸甲酯和植物油組成。

植物油優選為菜籽油、玉米油、花生油、大豆油或葵花籽油。

一種多殺菌素的補料發酵液的分離純化方法，包括如下步驟：

（1）按體積比為1：0.5-1.5的比例，向補料發酵液中加入等體積的丙酮，混勻后于無光照條件下靜止18-30h，離心后保留上清液；

（2）將上清液調pH至10-11，以40-70mL/h的流速過大孔樹脂進行動態吸附；分別用去離子水和體積濃度為30%-95%的丙酮水溶液進行梯度洗脫；

（3）收集體積濃度為95%的丙酮水溶液的洗脫液進行超濾、納濾，得到濃縮液；

（4）用乙酸乙酯萃取濃縮液，用旋轉蒸發蒸去乙酸乙酯后得到多殺菌素。

大孔樹脂的型號優選為：D3520、HDP300、D101、X-5、HDP100或NKA。

本發明的方法多殺菌素產量較高，達到804.59mg/L，比未進行補料的對照組提高了108.42%。產品純度高達95.43%，泄漏率較低，收率達87.0%。