[發(fā)明專(zhuān)利]一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310753413.2
• 申請(qǐng)日: 2013-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103725674A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬立新;陳晚蘋(píng);陳羽西;汪曉娟;楊琥;余先紅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 武漢金堂專(zhuān)利事務(wù)所 42212
• 代理人: 丁齊旭

1.一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法，其特征在于主要步驟包括：構(gòu)建LIC載體質(zhì)粒LIC-A；LIC-A線性載體的制備；構(gòu)建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana；選擇目標(biāo)基因，劃分300bp左右的小片段進(jìn)行合成；多個(gè)小片段DNA用金門(mén)克隆反應(yīng)組裝成大片段基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法，其特征在于具體步驟為：

1）、構(gòu)建LIC載體LIC-A

以商品化的pet23a和pLP-VSVG載體用常規(guī)方法構(gòu)建T7-sfgfp質(zhì)粒，以sfgfp-PF/PBR–PR、T7-sfgfp質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到線性載體骨架LIC；設(shè)計(jì)SPC-PF/SPC-PR為兩對(duì)引物，以T7-sfgfp為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到SPC盒式結(jié)構(gòu)；擴(kuò)增好的SPC盒式結(jié)構(gòu)的兩端都帶上了一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)BciVI和13bp的片段填充序列和T7啟動(dòng)子下游的10個(gè)堿基的序列；其次，在載體骨架LIC和SPC盒式結(jié)構(gòu)兩端引入20bp的同源序列，擴(kuò)增獲得的SPC盒式結(jié)構(gòu)，通過(guò)無(wú)酶克隆的方式克隆到載體骨架LIC上；經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切和測(cè)序鑒定得到正確的LIC-A載體質(zhì)粒；

2）、LIC-A線性載體的制備（如圖2所示），把測(cè)序正確的LIC-A質(zhì)粒先用限制性內(nèi)切酶BciVI在37℃酶切，并凝膠回收后的產(chǎn)物，然后再用T4DNA聚合酶3次分別在加dGTP、dCTP、dTTP的保護(hù)下12℃利用T4DNA聚合酶消化30min，溶液回收后備用，這樣處理的載體在其3’端各突出13nt；

3）、構(gòu)建組裝DNA片段的受體載體puc-Kana

首先，以PBR322-PF/PBR322-PR為引物，以商品化的puc-19質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得線性骨架載體片段PBR322；以gfp-PF/gfp-PR為引物，以pGSilG-Lic為模板，通過(guò)PCR獲得兩端帶有BspQI酶切位點(diǎn)和EarI酶切位點(diǎn)的gfp盒式結(jié)構(gòu)；以Kana-PF/Kana-PR為引物，以pGSilG-Lic為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得Kana盒式結(jié)構(gòu)；其次，通過(guò)重疊延伸PCR(Overlap?Extension?PCR)將gfp盒式結(jié)構(gòu)和Kana盒式結(jié)構(gòu)拼接成gfp-Kana單元；

最后，將gfp-Kana單元和線性骨架載體片段PBR322進(jìn)行1:3混合通過(guò)無(wú)酶克隆方式轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Gold進(jìn)行克隆；挑取在藍(lán)光儀下發(fā)綠光的菌落，通過(guò)質(zhì)粒電泳、質(zhì)粒酶切鑒定和質(zhì)粒測(cè)序等方式得到了正確的大小為3686bp的puc-Kana質(zhì)粒；

4）、選擇目標(biāo)基因，劃分300bp左右的小片段進(jìn)行合成

先選擇確定目標(biāo)基因XY，將需要合成的目標(biāo)基因的DNA序列按照每300bp左右進(jìn)行劃分為G1、G2、G3、G4、G5……多個(gè)小片段，分別設(shè)計(jì)彼此重疊（over?lapping）17bp左右且無(wú)縫的引物序列對(duì)，每個(gè)300bp左右的片段需要合成12條長(zhǎng)度為40-45nt左右的寡核苷酸引物；再分別將合成好的12條寡核苷酸序列稀釋成終濃度10μM，然后分別取0.5μL至一PCR管內(nèi)，加2ul的LA?Taq?Buffer最后加雙蒸水至終體積20μL混合；分別讓其按照94℃5min，94℃à37℃slope20min，37℃7min的逐步降溫的程序退火，且首尾兩條引物的5’端分別引入13nt與線性載體同源互補(bǔ)的序列；

將步驟2）準(zhǔn)備好的線性載體與退火形成的小DNA片段混合，37℃放置30min后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)重構(gòu)T7啟動(dòng)子啟動(dòng)下游報(bào)告基因sfgfp的表達(dá)，將篩選后測(cè)序正確重組子分別命名為XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5……；

5）、多個(gè)小片段DNA組裝成大片段基因

要合成大于300bp以上的DNA片段，需要用步驟4的XYG1、XYG2、XYG3、XYG4、XYG5……質(zhì)粒作為供體質(zhì)粒，再另加切好的受體載體質(zhì)粒puc-Kana做金門(mén)克隆反應(yīng)，這樣就合成了與目標(biāo)基因相同的合成基因。