[發明專利]一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法

有效

• 申請號: 201310753413.2
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103725674A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 馬立新;陳晚蘋;陳羽西;汪曉娟;楊琥;余先紅
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 武漢金堂專利事務所 42212
• 代理人: 丁齊旭

技術領域

本發明涉及一種基因合成方法的研究，是一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

合成生物學是生命科學在二十一世紀剛剛出現的一個分支學科，近年來合成生物學的研究進展很快，特別是基因合成技術。全基因合成是依照某一蛋白質的基因序列，設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過重疊延伸PCR法拼接出全長，基因合成無需模板，是獲取基因的手段之一。通過全基因合成實現基因的分子改造和人工組建正成為一種實驗室常規手段。因此，建立一種能夠在相對低廉和短時間內準確和高效地設計和合成長片段基因的方法十分重要。

隨著合成生物學的研究越來越流行，人們對生命的探究不再僅僅局限在宏觀生物上，而是從更簡單的基本單元基因著手，至從上個世紀70年代以來分子生物學基因工程迅猛發展，到目前為止DNA合成的方法主要集中3種方法：（1）化學合成方法，由于化學合成的原理決定了化學法合成的DNA片段不可能太長，所以主要用于寡核苷酸的合成；（2）PCR介導的合成方法，這種方法是可以合成大的DNA片段，而且周期也比較短，但是到目前為止，PCR介導的合成方法錯誤率比較高，尤其對于合成大于2kb以上的DNA由于錯誤率高，所以為了得到正確的克隆，需要做多次克隆和測序的重復工作，這樣成本會很高;而且由于是PCR介導的方法，需要DNA高溫聚合酶和DNTP等試劑，這樣成本會比較高;(3)非PCR介導的方法，到目前為止報道的基于非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技術。這種固相合成技術，在合成中的錯誤率確實大大降低了很多，但是由于在合成的時候引物需要經過特殊的修飾，再加上該方法需要建庫，引物成本會比較高；其次是由于該方法每次只能增加3個堿基，這樣合成的速度會比較慢，特別對于大的DNA片段的合成，周期尤為長，雖然可以實現自動化操作，但是對于一般的實驗室研究不是很實用。

鑒于目前的基因合成的方法中錯誤率高，合成成本高等問題，有必要尋找新的基因合成方法來解決現有技術存在的問題。

發明內容

本發明的目的是提出一種在大腸桿菌中一步法合成DNA片段并組裝合成基因的一種新的基因合成方法。該方法利用大腸桿菌自身的修復機制，在大腸桿菌中一步法合成DNA片段，并把DNA小片段組裝合成基因。主要步驟包括：載體的改造，線性載體的制備，小DNA片段的合成，組裝DNA片段的載體的構建，多個300bp左右的DNA片段的組裝合成基因。

具體做法如下：

1）、構建LIC載體LIC-A。

以商品化的pet23a和pLP-VSVG載體用常規方法構建T7-sfgfp質粒，以sfgfp-PF/PBR–PR、T7-sfgfp質粒為模板，通過PCR擴增得到線性載體骨架LIC（3.5kb）(序列列表對應為NO1)；設計SPC-PF/SPC-PR(序列見表1)為兩對引物，以T7-sfgfp為模板，通過PCR擴增得到SPC盒式結構（1kb）(序列列表對應為NO2)，擴增好的SPC盒式結構的兩端都帶上了一個限制性酶切位點（BciVI）和13bp的片段填充序列和T7啟動子下游的10個堿基的序列；其次，在載體骨架LIC-A和SPC盒式結構兩端引入了20bp的同源序列，擴增獲得的SPC盒式結構，通過無酶克隆的方式（Zhu?D,Zhong?X,Tan?R,Chen?L,Huang?G,Li?J,et?al.High-throughput?cloning?of?human?liver?complete?open?reading?frames?using?homologous?recombination?in?Escherichia?coli.[J]Anal?Biochem.2010;397(2):162-7）克隆到載體骨架LIC-A上。經過限制性內切酶酶切和測序鑒定得到正確的LIC-A載體質粒(序列列表對應為NO3)，命名為LIC-A載體質粒（構建過程見圖1）。

表1骨架載體LIC-A構建中使用的引物

2）、LIC-A線性載體的制備（如圖2所示）。把測序正確的LIC-A質粒先用限制性內切酶BciVI在37℃酶切，并凝膠回收后的產物，然后再用T4DNA聚合酶3次分別在加dGTP、dCTP、dTTP的保護下12℃利用T4DNA聚合酶3’-5’外切酶活性的作用消化30min，溶液回收后備用，這樣處理的載體在其3’端各突出13nt。