[發明專利]化學合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段及其表達、應用

在審

• 申請號: 201310751324.4
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103725698A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李越希;許桂麗;蔡冉;潘英;李素芹;李丙軍;陳樂如;周潔;張素芬;馬穎;袁敬宇;徐悅玥;尚彥紅
• 申請（專利權）人: 李越希
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;C07K16/12;G01N33/569
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

技術領域

本發明涉及的是化學合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段，利用基因工程技術，制備重組金黃色葡萄球菌的表面蛋白ClfA。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的ClfA片段，選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達，表達的蛋白可用于疫苗及金黃色葡萄球菌快速檢測等，本發明涉及基因工程技術和診斷試劑領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌是一種重要的人獸共患病原菌，是一種世界公認的導致人類和動物化膿性疾病的致病因子，也是引起食物中毒的重要因子。它能導致皮膚和軟組織感染以及危及生命的菌血癥轉移性并發癥，如肺炎、心內膜炎、化膿性關節炎和骨髓炎。金黃色葡萄球菌在醫院內是一個可以檢測的病原體，它會導致免疫功能低下的宿主、手術病人和留置醫療設備感染。

????傳統鑒定和分離金黃色葡萄球菌的方法步驟較多，并且具有一定的局限性。大多數免疫學技術例如熒光標記抗體實驗、酶聯免疫試驗（ELISA）、放射性免疫試驗等都得到廣泛應用，但它們所需成本較高、耗時且需對樣品進行復雜的處理，限制其在生活中的廣泛應用。建立一種簡單、快速、適合現場應用的金黃色葡萄球菌的檢測方法有重要的意義。

金黃色葡萄球菌產生的細胞外結合基質蛋白（ECMBP），包括FnBP、ClfA?和Ebp等，它們均為細菌表面的蛋白成分，具有相似的結構。其中，?ClfA在細菌生長的各個階段都出現，且幾乎存在于所有金黃色葡萄球菌表面，是金黃色葡萄球菌表面重要的粘附素，可介導金黃色葡萄球菌粘附到宿主基質蛋白上，這是金黃色葡萄球菌感染的重要一步。金黃色葡萄球菌在生長期內都有產生ClfA，靜止期內大量表達。不同菌株中ClfA的功能結構域高度保守，促使ClfA成為金黃色葡萄球菌抗體研究中的熱門粘附因子。有報告指出，用免疫熒光技術分析野生型NewMan株和clfa::Tn917?NewMan突變株抗ClfA?A區是裸露在細菌細胞表面的。通過用試紙條檢測金黃色葡萄球菌菌液的陽性結果可以說明CIfA蛋白很可能是暴露與金黃色葡萄球菌加膜外蛋白或者說不被莢膜完全遮蔽。

發明內容

本發明是化學合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全新基因片段，利用基因工程技術，制備重組金黃色葡萄球菌的ClfA的部分片段。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的部分片段?,第40個氨基酸--第194個?氨基酸，共155個氨基酸，選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術在大腸桿菌BL21(DE3)中表達該基因。表達的蛋白可用于疫苗，亦可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備為金黃色葡萄球菌檢測方法的建立奠定了基礎。

通過計算機軟件分析，篩選出金黃色葡萄球菌的特異性表面蛋白ClfA抗原表位富集區，選擇原核生物偏愛的密碼子優化基因序列，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達。表達的蛋白具有較好的抗原性和特異性，可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，組裝膠體金試劑條，為金黃色葡萄球菌快速檢測方法的建立奠定基礎。

化學合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的155個氨基酸的基因片段及其表達、應用是采取以下步驟實現的：?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????

1．金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成：

利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機分析金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全氨基酸序列，發現金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的N端（第40氨基酸?—?第194?氨基酸）含有較強的抗原決定簇。選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamH?I酶切位點（下畫線部分），在3'端增加了終止密碼子（TGA）和Xho?I酶切位點（下畫線部分），使該基因片段易于克隆至質粒pGEX4T-2的BamH?I和Xho?I酶切位點內。

篩選的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA內的抗原表位氨基酸序列（第40個aa－第194個aa）：