[發(fā)明專利]化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310751324.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103725698A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李越希;許桂麗;蔡冉;潘英;李素芹;李丙軍;陳樂如;周潔;張素芬;馬穎;袁敬宇;徐悅玥;尚彥紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李越希
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;C07K16/12;G01N33/569
• 代理公司: 南京君陶專利商標(biāo)代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

1.一種化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，該基因片段編碼含強(qiáng)抗原表位的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，即第40個(gè)氨基酸至第194個(gè)氨基酸，共155個(gè)氨基酸，在該基因片段的5'端增加了BamH?I酶切位點(diǎn)，在3'端增加了終止密碼子TAA和Xho?I酶切位點(diǎn)，化學(xué)合成的基因序列全長(zhǎng)480bp，序列如下：

GGATCC??AGC?GAA?AAT?AGC?GTG?ACC?CAA?AGC?GAC?TCC?GCC?TCA?AAC?GAA?AGC?AAA?TCC?AAT?GAC?TCA?AGT?TCT?GTC?TCA?GCA?GCA?CCG?AAG?ACG?GAT?GAC?ACC?AAT?GTC?TCG?GAT?ACG?AAA?ACC?AGC?TCT?AAC?ACG?AAC?AAT?GGC?GAA?ACC?AGC?GTG?GCG?CAG?AAT?CCG?GCC?CAG?CAA?GAA?ACC?ACG?CAA?AGT?TCC?TCA?ACC?AAC?GCG?ACC?ACG?GAA?GAA?ACG?CCG?GTT?ACC?GGT?GAA?GCC?ACC?ACG?ACC?ACG?ACC?AAC?CAG?GCA?AAT?ACG?CCG?GCT?ACG?ACC?CAA?TCG?AGC?AAC?ACC?AAT?GCA?GAA?GAA?CTG?GTC?AAT?CAG?ACC?TCT?AAC?GAA?ACG?ACC?TTT?AAC?GAC?ACG?AAT?ACC?GTG?TCT?AGT?GTT?AAT?TCC?CCG?CAG?AAC?TCA?ACC?AAT?GCC?GAA?AAC?GTG?TCA?ACG?ACC?CAG?GAT?ACC?AGC?ACG?GAA?GCG?ACC?CCG?AGC?AAC?AAC?GAA?TCA?GCA?CCG?CAG?TCA?ACC?TAA?CTCGAG?。

2.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，采用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因序列編碼的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，純化表達(dá)的蛋白片段，具體方法如下：

金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建:

用?BamH?I和Xho?I雙酶切質(zhì)粒pGEX4T-2和化學(xué)合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，電泳回收后，用T4?DNA?連接酶連接，使金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段插入到載體pGEX4T-2內(nèi)的BamH?I和Xho?I位點(diǎn)之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個(gè)融合蛋白，全長(zhǎng)381個(gè)氨基酸,該融合蛋白N端融合了載體上的226個(gè)氨基酸，C端包含金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA內(nèi)的第40個(gè)氨基酸至第194個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)氨基酸序列如下：

Met?Ser?Pro?Ile?Leu?Gly?Tyr?Trp?Lys?Ile?Lys?Gly?Leu?Val?Gln?Pro?Thr?Arg?Leu?Leu?Leu?Glu?Tyr?Leu?Glu?Glu?Lys?Tyr?Glu?Glu?His?Leu?Tyr?Glu?Arg?Asp?Glu?Gly?Asp?Lys?Trp?Arg?Asn?Lys?Lys?Phe?Glu?Leu?Gly?Leu?Glu?Phe?Pro?Asn?Leu?Pro?Tyr?Tyr?Ile?Asp?Gly?Asp?Val?Lys?Leu?Thr?Gln?Ser?Met?Ala?Ile?Ile?Arg?Tyr?Ile?Ala?Asp?Lys?His?Asn?Met?Leu?Gly?Gly?Cys?Pro?Lys?Glu?Arg?Ala?Glu?Ile?Ser?Met?Leu?Glu?Gly?Ala?Val?Leu?Asp?Ile?Arg?Tyr?Gly?Val?Ser?Arg?Ile?Ala?Tyr?Ser?Lys?Asp?Phe?Glu?Thr?Leu?Lys?Val?Asp?Phe?Leu?Ser?Lys?Leu?Pro?Glu?Met?Leu?Lys?Met?Phe?Glu?Asp?Arg?Leu?Cys?His?Lys?Thr?Tyr?Leu?Asn?Gly?Asp?His?Val?Thr?His?Pro?Asp?Phe?Met?Leu?Tyr?Asp?Ala?Leu?Asp?Val?Val?Leu?Tyr?Met?Asp?Pro?Met?Cys?Leu?Asp?Ala?Phe?Pro?Lys?Leu?Val?Cys?Phe?Lys?Lys?Arg?Ile?Glu?Ala?Ile?Pro?Gln?Ile?Asp?Lys?Tyr?Leu?Lys?Ser?Ser?Lys?Tyr?Ile?Ala?Trp?Pro?Leu?Gln?Gly?Trp?Gln?Ala?Thr?Phe?Gly?Gly?Gly?Asp?His?Pro?Pro?Lys?Ser?Asp?Leu?Val?Pro?Arg?Gly?Ser?Ser?Glu?Asn?Ser?Val?Thr?Gln?Ser?Asp?Ser?Ala?Ser?Asn?Glu?Ser?Lys?Ser?Asn?Asp?Ser?Ser?Ser?Val?Ser?Ala?Ala?Pro?Lys?Thr?Asp?Asp?Thr?Asn?Val?Ser?Asp?Thr?Lys?Thr?Ser?Ser?Asn?Thr?Asn?Asn?Gly?Glu?Thr?Ser?Val?Ala?Gln?Asn?Pro?Ala?Gln?Gln?Glu?Thr?Thr?Gln?Ser?Ser?Ser?Thr?Asn?Ala?Thr?Thr?Glu?Glu?Thr?pro?Val?Thr?Gly?Glu?Ala?Thr?Thr?Thr?Thr?Thr?Asn?Gln?Ala?Asn?Thr?pro?Ala?Thr?Thr?Gln?Ser?Ser?Asn?Thr?Asn?Ala?Glu?Glu?Leu?Val?Asn?Gln?Thr?Ser?Asn?Glu?Thr?Thr?Phe?Asn?Asp?Thr?Asn?Thr?Val?Ser?Ser?Val?Asn?Ser?Pro?Gln?Asn?Ser?Thr?Asn?Ala?Glu?Asn?Val?Ser?Thr?Thr?Gln?Asn?Thr?Ser?Thr?Glu?Ala?Thr?Pro?Ser?Asn?Asn?Glu?Ser?Ala?Pro?Gln?Ser?Thr

表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定:

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布含100μg／ml氨芐青霉素的LB平板，置37℃?過(guò)夜，次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和含質(zhì)粒pGEX4T-2的對(duì)照菌，提取質(zhì)粒?，雙酶切驗(yàn)證,切出480bp的目的條帶；將含有外源基因的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒含有金黃色葡萄球菌ClfA基因片段，序列完全正確；將含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種至含氨芐青霉素100μg／mL?的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)4h，加IPTG至終濃度0.2?mmol/L,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)4h，離心收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),重組子表達(dá)相對(duì)分子量約為42?kD的金葡菌表面蛋白ClfA，表達(dá)量約為25%，而含空質(zhì)粒pGEX4T-2的對(duì)照菌無(wú)此蛋白帶；

表達(dá)金黃色葡萄球菌表面蛋白ClfA的純化：

將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的工程菌離心，收菌，菌體重懸于裂解液，裂解液為20mmol/L?PB?pH8.0、10mmol/L?EDTA、1mmol/L?DTT、5%甘油，冰浴超聲破菌75次，離心收集上清，上清溶液加已經(jīng)平衡的High-Affinity?GSH?Resin凝膠10ml，4℃結(jié)合過(guò)夜,上樣，收集穿透液；用十倍柱床體積的1×PBS洗滌柱子，接著用50ml高濃度的GSH洗脫液，洗脫液為50?mmol/L?Tris-HCl?pH8.0?+?10?mmol/L?GSH，分三次洗脫目的蛋白,即為純化的金葡菌ClfA蛋白片段。