[發明專利]一種通用型重組表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201310750733.2
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103725705A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 趙琦;劉婕;萬曉春
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種通用型重組表達載體及其構建方法和應用。

背景技術

蛋白標簽大體可分為三大類：遺傳標簽、in?vivo標簽和in?vitro標簽。使用帶有遺傳標簽（如c-Myc、FLAG）的載體表達蛋白是分子克隆的常用技術，將目的基因對框克隆到含有標簽的載體上，可便于下游通過抗體或熒光檢測。此外，還有促進蛋白質可溶性表達的標簽、便于蛋白質純化的標簽等。Sigma-Aldrich和安捷倫（原Stratagene公司）提供了一些常見的帶有FLAG、c-Myc或CBP（鈣調蛋白結合肽段）的載體系統。

蛋白標簽的作用巨大，所以有必要提供一種攜帶多種標簽的通用載體，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種通用型重組表達載體，該表達載體攜帶有多種功能標簽；本發明還提供了一種通用型重組表達載體的構建方法和應用，將構建的通用型重組表達載體應用于外源蛋白的生產，便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化。

本發明采用的英文縮寫及其中文釋義或Genebank登錄號如下：

His：組氨酸標簽；c-myc：本發明采用的c-myc標簽的的氨基酸序列為EQKLISEEDL；

flag：本發明采用的flag標簽的氨基酸序列為DYKDDDDK；

HA：本發明采用的HA標簽的氨基酸序列為YPYDVPDYA；

GST：谷胱甘肽S-轉移酶標簽，本發明采用的GST標簽的Genebank登錄號為：L29345；

GFP：綠色熒光蛋白標簽，本發明采用的GFP標簽的Genebank登錄號為：U12472。

第一方面，本發明提供了一種通用型重組表達載體，所述通用型重組表達載體為將多功能標簽的編碼基因插入到原核表達質粒或真核表達質粒的多克隆位點后得到的重組載體；所述多功能標簽的編碼基因包括His,c-myc,flag,HA,GST和GFP標簽的編碼基因中的至少一種，所述原核表達質粒為pET28，pET32或pGEX，所述真核表達質粒為pcDNA3.1或pPICZ。

優選地，所述pET28為pET28a或pET28b。

優選地，所述pET32為pET32a、pET32b或pET32c。

優選地，所述pGEX為pGEX4T-1、pGEX4T-2。

優選地，所述pcDNA3.1為pcDNA3.1/His?A、pcDNA3.1/His?B或pcDNA3.1/His?C。

優選地，所述pPICZ為pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC。

優選地，所述多功能標簽的編碼基因插入到所述pET32a、pET32b或pET32c質粒的NcoI位點和NotI位點之間。

優選地，所述多功能標簽的編碼基因中順次連接有所述GFP，HA，Flag，GST，c-myc標簽的編碼基因。

更優選地，所述GFP標簽和HA標簽的編碼基因之間插入有SGSG氨基酸序列的基因編碼序列。

更優選地，所述HA標簽和Flag標簽的編碼基因之間插入有GG氨基酸序列的基因編碼序列。

更優選地，所述Flag標簽和GST標簽的編碼基因之間插入有GGGGSGGGGS氨基酸序列的基因編碼序列。

具體的，所述GGGGSGGGGS氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

更優選地，所述GST標簽和c-myc標簽的編碼基因之間插入有氨基酸G的基因編碼序列。

在此優選條件下，所述多功能標簽的編碼基因插入到所述pET32a、pET32b或pET32c質粒的NcoI位點和NotI位點之間；得到可表達GFP、HA、flag、GST和c-myc共5種標簽的通用型重組表達載體；由于pET32a、pET32b或pET32c質粒本身還帶有His標簽，在此優選條件下，所述的表達5種標簽的通用型重組表達載體還可以通過選擇合適的酶切位點，在要表達的目標外源蛋白的N端或C端帶上His標簽。

此外，在此優選條件下，采用本發明提供的所述的表達5種標簽的通用型重組表達載體，由于所述GFP、HA、flag、GST和c-myc標簽之間采用多種親水氨基酸序列進行連接，比如SGSG、GG、GGGGSGGGGS和G等親水氨基酸序列，可以增強標簽之間的柔性和可折疊性，降低各標簽之間功能位點的相互影響，充分發揮標簽的功能。