[發(fā)明專利]β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的檢測方法、系統(tǒng)及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310750659.4
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103645273A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設計）人: 佟雪梅;趙煥鑄
• 申請（專利權(quán)）人: 佟雪梅
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/72
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藥物檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的檢測方法、系統(tǒng)及其應用。?

背景技術(shù)

β-內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯類和青霉烯類酶抑制劑等，由于其具有殺菌活性強、毒性低、適應癥廣及臨床療效好的優(yōu)點，在臨床上得到了廣泛的使用。?

耐藥性（Resistanceto?Drug）又稱抗藥性，系指微生物、寄生蟲以及腫瘤細胞對于化療藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的化療作用就明顯下降。?

微生物對抗生素產(chǎn)生耐藥的機制包括:(1)細胞膜通透性的改變,使抗生素不能,或很少透入微生物體內(nèi)到達作用靶位;(2)滅活酶或鈍化酶的產(chǎn)生,如產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,使抗生素失效;(3)與抗生素結(jié)合靶位(親和力)的改變,使抗生素的作用下降;(4)其他,如主動外排系統(tǒng)(泵出機制)等。其中由β-內(nèi)酰胺酶介導的抗生素耐藥性發(fā)展迅速。對由該機制引起的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的檢測受到廣泛的關(guān)注。?

相關(guān)技術(shù)中，由于β-內(nèi)酰胺酶的分解作用導致β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生的耐藥性，體外檢測的方法包括手工方法和自動化儀器法，?在手工方法中普遍采用紙片擴散法，在自動化儀器法中常采用比濁法。?

紙片擴散法是將含有定量β-內(nèi)酰胺類抗生素的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，β-內(nèi)酰胺類抗生素的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負相關(guān)。?

比濁法是將抗生素干燥固化在樣本板上，板子有64-100個孔，可以放置20-50個不同濃度的抗生物底物。將含有細菌的肉湯加載在板子上，在自動化儀器上進行濁度的讀取。透明為敏感，有濁度為耐藥（有細菌生長）。時間為6-24小時，個別需48小時。?

上述紙片擴散法和比濁法均存在以下問題：檢測過程中受到微生物濃度、純度和操作者操作技術(shù)高低等多種因素的影響，檢測準確度低，檢測時間長。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供微生物對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的檢測方法、系統(tǒng)及其應用，以解決上述的問題。?

在本發(fā)明的實施例中第一方面提供了一種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的檢測方法，包括：?

制備濃度為0.5-0.6麥氏單位的待測微生物的懸濁液；?

將所述待測微生物的懸濁液與β-內(nèi)酰胺類抗生素的標準液按照體積比1:1-1:2的比例混合均勻，靜置20-30分鐘，得到混合液；?

從所述混合液中除去所述待測微生物，得到待測液；?

獲取所述待測液的液相色譜圖；?

若液相色譜圖中包含β-內(nèi)酰胺類抗生素的標志峰及其β-內(nèi)酰胺作用的碎片峰，則判定所述待測微生物對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥；?

若液相色譜圖中包含β-內(nèi)酰胺類抗生素的標志峰，但不包含其β-內(nèi)酰胺作用的碎片峰，則判定所述待測微生物對β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感。?

具體地，所述β-內(nèi)酰胺類抗生素的標準液包括：?

濃度為敏感標準濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素標準液、濃度為中介耐藥濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素標準液和耐藥標準濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素標準液；?

所述混合液包括：所述待測微生物的懸濁液分別與所述敏感標準濃度、所述中介耐藥濃度和所述耐藥標準濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素標準液混合得到的三種混合液；?

所述待測液包括：將上述三種混合液分別除去所述待測微生物，得到對應敏感標準濃度的敏感待測液、對應中介耐藥濃度的中介待測液、對應耐藥標準濃度的耐藥待測液；?

獲取所述待測液的液相色譜圖包括：分別獲取上述三種待測液的液相色譜圖；?

所述判定包括：?

若所述三種待測液的液相色譜圖中，均包含β-內(nèi)酰胺類抗生素的標志峰及其β-內(nèi)酰胺作用的碎片峰，則判定所述待測微生物對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥；?

若所述三種待測液的液相色譜圖中，均包含β-內(nèi)酰胺類抗生素的標志峰但均不包含β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺作用的碎片峰，則判定所述待測微生物對β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感。?

進一步地，判定還包括：?