[發明專利]一種快速檢測多種致病菌的方法在審

申請號：	201310749891.6	申請日：	2013-12-31
公開（公告）號：	CN104749366A	公開（公告）日：	2015-07-01
發明（設計）人：	葛玉卿;金慶輝;毛紅菊;趙建龍	申請（專利權）人：	中國科學院上海微系統與信息技術研究所
主分類號：	G01N33/577	分類號：	G01N33/577;G01N21/31;B82Y15/00
代理公司：	上海智信專利代理有限公司 31002	代理人：	潘振甦
地址：	200050 ***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種快速檢測多種致病菌方法
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【權利要求書】：

1.一種快速檢測多種致病菌的方法，其特征在于首先是雙功能復合納米球的制備，所述的雙功能復合納米球是采用二氧化硅同時包埋不同尺寸的量子點和磁性納米顆粒，構建多種具有不同光學特性和超順磁性的雙功能復合納米球；然后，雙功能復合納米球表面改性后，分別將不同尺寸的量子點和磁性納米球構成的雙功能納米球與具有特異性識別目標菌的單克隆抗體連接，得到幾種能夠與目標菌表面抗原進行抗原-抗體反應的免疫量子點探針和免疫復合納米球探針；最后通過在相應波長下檢測其光學強度就可以實現多種致病菌的檢測。

2.按權利要求1所述的方法，其特征在于：

a)所述的雙功能復合納米球中所包埋的磁性納米顆粒是經過表面修飾的Fe₃O₄納米顆粒或者γ-Fe₂O₃納米顆粒；包埋的量子點是經過表面修飾的碲化鎘量子點或硒化鎘量子點，所述量子點具有幾種不同的光學特性和尺寸，從而形成幾種具有不同光學性質的雙功能復合納米球；

b)所述的雙功能復合納米球的制備是通過經改進的方法，具體步驟包括：

（1）水、乙醇、氨水按照一定比例混合；上限體積比為33:16:1，下限體積比為20:16:15；

（2）加入磁性納米顆粒和量子點；

（3）加入正硅酸乙脂和乙醇的混合液，攪拌反應，生成納米球；混合液的上限體積比為4:21，下限體積比為1:24；

（4）磁分離和乙醇清洗，真空干燥。

3.按權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的雙功能復合納米球尺寸范圍為50-600nm。

4.按權利要求1所述的方法，其特征在于雙功能復合納米球表面改性是利用雙功能復合納米球表面的官能團，用偶聯劑將雙功能復合納米球和目標致病菌相應的單克隆抗體連接，獲得具有一定光學性能的免疫復合納米線探針。

5.按權利要求1或4所述的方法，其特征在于加入具有不同光學特性的量子點，以改變雙功能復合納米球的光學性能。

6.按權利要求1或4所述的方法，其特征在于將所述不同的免疫復合納米探針混合，加入待測菌液，免疫磁分離不同目標菌經緩沖液洗滌后加入不同免疫量子點探針，進行識別標識，通過不同尺寸免疫量子點探針的特征吸收峰，實現待測菌的檢測，具體是被測的多種食源性病菌使用四種免疫復合納米探針，他們的發射波射分別為481nm、518nm、565nm和610nm；也即分別將腸出血性太陽桿菌抗體、沙門氏菌抗體、單核細胞增生李斯特氏菌抗體和彎曲菌抗體四種致病菌與相應的量子點連接形成四種量子點探針。

7.按權利要求6所述的方法，其特征在于所述的免疫復合納米球探針作為免疫識別分離多種致病菌的載體或作為免疫量子點的信號增強，實現待測菌的免疫磁分離和實現光學信號的二次放大。

8.按權利要求1或6所述的方法，其特征在于所述的方法包括：

（1）構建幾種同時具有磁性和不同光學性能的雙功能納米球之后，構建四種免疫雙功能納米球探針，即分別將特異性識別目標食源性致病菌的單克隆抗體與雙功能納米球連接；

（2）構建免疫量子點探針，即分別將特異性識別目標食源性致病菌的單克隆抗體與相應的量子點連接形成免疫量子點探針；探針所標記的抗體、量子點尺寸與免疫復合納米球中標記的抗體、包埋量子點的尺寸一一對應，以與免疫復合納米球探針、目標食源性致病菌形成類似三明治結構；

（3）采用三明治夾心免疫分析法對目標食源性致病菌進行檢測；檢測步驟包括：

步驟a）：樣品的預處理

按照不同樣品的性質進行相應的預處理，制備成合適的樣品溶液1mL-5mL；

步驟b）：目標致病菌的富集

將幾種免疫雙功能納米球探針加入到樣品溶液中，共孵育，充分反應后，磁分離除去上清液，緩沖液洗滌兩次，以達到去除雜菌的目的，從而得到包含目標致病菌和納米球探針的緩沖溶液；

步驟c）：免疫量子點探針標記

在步驟b）所述樣品中加入一定量的相應免疫量子點探針，共孵育，充分反應后，磁分離除去上清液，緩沖液洗滌兩次，可以去除多余的量子點探針，得到形成量子點探針-目標致病菌-納米球探針的類似三明治結構的緩沖溶液；

步驟d）：熒光測定