[發(fā)明專利]利用海南粗榧非胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310749388.0
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103725725A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬飛;江雪飛;王榮香;王琴飛;叢漢卿;錢丹;趙小青;尹俊梅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: C12P17/02
• 分類號: C12P17/02
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用海南粗榧非胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其前體物巴卡亭III的方法。?

背景技術(shù)

海南粗榧(Cephalotaxus?mannii?Hook.f.)是三尖杉科(Cephalotaxaceae)三尖杉屬(Cephalotaxus)常綠喬木。主產(chǎn)海南島，在廣東西南部、廣西東南部、云南東南部及西部、西藏東南部也有分布。散生于海拔700-1200米山地雨林或季雨林區(qū)溝谷、溪澗或山坡。海南粗榧是三尖杉屬分布最南的種，同時又是慢生樹種，由于生態(tài)分布狹窄加之人為破壞，其分布區(qū)面積在不斷縮小，已于1987年被列入國家二級重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物。?

海南粗榧次生代謝產(chǎn)物中富含多種生物堿，已經(jīng)確定的有：脫氧三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、三尖杉堿、橋氧粗榧堿、去甲基三尖杉酯堿、羥基三尖杉堿和3-表西哈滅里辛堿。其中，具有抗癌活性的有4種：三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、脫氧三尖杉酯堿和異三尖杉酯堿。我們首次發(fā)現(xiàn)在海南粗榧中還具有抗癌物質(zhì)紫杉醇。?

紫杉醇（paclitaxel，taxol），又名泰素、紫素、特素?；瘜W(xué)名稱為5β，20-環(huán)氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R，3’S)-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯，分子量853.92，分子式C₄₇H₅₁NO₁₄。于1963年在太平洋紅豆杉中發(fā)現(xiàn)。紫杉醇是細(xì)胞有絲分裂抑制劑，被廣泛用于癌癥治療。主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤等疾病也有一定的療效。其基本作用原理是特異性的結(jié)合到細(xì)胞微管骨架蛋白上，干擾細(xì)胞微管骨架的解聚和重組，從而影響微管的基本生理功能，阻斷了細(xì)胞分裂，抑制癌細(xì)胞生長。?

紫杉醇的分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，一種四環(huán)二萜化合物，有11個立體中心和一個17碳的四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，有眾多的研究機(jī)構(gòu)對其進(jìn)行了人工化學(xué)合成方面的研究。目前已公開的全合成途徑有兩種：一種是由A環(huán)再形成ABC環(huán)或由C環(huán)再?形成ABC環(huán)，此種為線形戰(zhàn)略，Holton和Wengder采用此方法完成了全合成。另一種是由A環(huán)和C環(huán)會聚形成ABC環(huán)，此種為會聚戰(zhàn)略。Nicolaou、Danishefsky和Kuwajima則采用會聚戰(zhàn)略完成了全合成。而Mukaiyama采用兩種方法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了全合成。雖然紫杉醇可以通過人工化學(xué)方法合成，但由于其合成過程復(fù)雜，步驟繁瑣，產(chǎn)品純度低、技術(shù)難度大，目前通過人工化學(xué)合成的紫杉醇或三尖杉生物堿還處于探索階段，還無法真正實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。?

紫杉醇的生物合成是非依賴甲羥戊酸途徑完成的，其生物合成路徑基本清楚，紫杉醇生物合成包括母核與側(cè)鏈兩部分，其生物合成是由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPs)催化形成GGPP前體物質(zhì)經(jīng)紫杉二烯合酶（tasy）催化作用下形成紫杉二烯，紫杉二烯在紫杉二烯-5α-羥化酶(h-5α)作用下生成紫杉二烯-5α-醇。它經(jīng)紫杉二烯-5α-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(tat)作用下形成紫杉二烯-5α-乙酰脂。然后經(jīng)過一系列交替進(jìn)行的羥基化和?；磻?yīng)生成了2α-去苯甲酰紫杉烷，再經(jīng)過紫杉烷-2α-苯甲酰轉(zhuǎn)移酶(tbt)和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-2乙酰轉(zhuǎn)移酶(dbat)兩步反應(yīng)作用下生成母核巴卡亭Ⅲ(baccatinⅢ)。而β-苯丙胺酸連接到巴卡亭Ⅲ的C₁₃位上，經(jīng)過3-氨基-3-苯基丙酰轉(zhuǎn)移酶(bapt)和3-N-去苯甲酰-2-脫氧紫杉醇苯甲酰轉(zhuǎn)移酶(dbtnbt)催化作用下發(fā)生酯化反應(yīng)生成了紫杉醇(taxol)。該生物合成途徑包含約20步酶促反應(yīng)中，已經(jīng)有一半以上的基因被克隆與表達(dá)。由于參與代謝的基因仍有許多不清楚，目前，仍然不能通過基因工程的方法進(jìn)行生產(chǎn)。?

巴卡亭III（Baccatin?III,C₃₁H₃₈O₁₁）是紫杉醇合成過程中的重要前體物，具有紫杉烷二萜的環(huán)骨架和官能團(tuán)。其在紅豆杉植物中普遍存在，由于枝葉中巴卡亭III含量較高，人們可以通過收獲紅豆杉植物的枝葉提取獲得巴卡亭III，然后通過化學(xué)合成的方法再合成抗癌藥物紫杉醇。此外，巴卡亭III自身也被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能，在器官移植等領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價值。?