[發明專利]一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法

有效

• 申請號: 201310748239.2
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103690951A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 趙成新;李曉麗;王先德;欒浩麟;房超;鄒德志;劉懷華
• 申請（專利權）人: 煙臺金海藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/40
• 分類號: A61K39/40;A61K9/107;A61P31/04;C12N1/20
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1.一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于：按如下步驟制得：

(1)菌種準備及細菌的增殖

將真空凍干保存的綠膿桿菌用生理鹽水按體積比1∶1稀釋，接種于NAC瓊脂培養基，在?37℃的培養箱中培養18～24小時，經純度檢驗沒有雜菌生長后，用生理鹽水制成菌懸液接種于LB瓊脂培養基，在37℃的培養箱中培養36～48小時后，收集細菌；

?(2)?制備滅活菌苗

將收集的細菌用生理鹽水懸浮成菌懸液，使每毫升菌懸液含150～200億個細菌，用終濃度0.3%甲醛在37℃下滅活24小時，即為制苗用抗原；把抗原乳化制成油乳劑滅活菌苗，并進行滅活菌苗的安全檢驗；

(3)?產蛋雞的免疫

選25周齡的健康產蛋母雞用安全檢驗合格的滅活菌苗進行免疫，免疫程序為：

第1次免疫：每只雞腿肌注射0.2ml，頸部皮下注射0.2ml，

第2次免疫：2周后每只雞頸部皮下注射1.0ml，

第3次免疫：?2周后，每只雞頸部皮下多點注射1.5ml；

(4)?高免蛋的收集

產蛋雞第3次免疫后14天，開始抽樣測定高免雞蛋黃中抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體效價，蛋黃與生理鹽水按體積比1∶3稀釋后，加入等體積三氯甲烷萃提，上清液瓊擴效價≥1∶16即為合格，之后收集雞蛋；

(5)?提取抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥

A、蛋殼消毒：將雞蛋浸入加熱至42℃的0.1%新潔爾滅水溶液中消毒25～35分鐘，取出涼干或吹干備用；

B、打蛋分離蛋黃：打蛋，充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集蛋黃；

C、萃提：先充分攪拌蛋黃呈均勻膏狀，然后加入3倍體積的高壓滅菌生理鹽水，再次充分攪拌混勻，使成為蛋黃液；在該蛋黃液中加入等體積的三氯甲烷，充分振蕩混合，靜置60分鐘后裝入離心管以3500～4000rpm離心30分鐘，收集離心管中的上清液；

D、加入滅活劑和穩定劑：上清液按終濃度為0.05%加入甲醛，充分攪拌混合，密封30～60分鐘后加入終濃度為0.02%的穩定劑吐溫-20，混勻；

E、除菌過濾：用0.2～0.3um微孔濾膜過濾除菌，即得到抗水貂綠膿桿菌性肺炎卵黃抗體獸藥；

(6)效價、安全檢驗，形成產品

效價用含氯化鈉的瓊脂為載體進行瓊擴試驗檢測，所述含氯化鈉的瓊脂是用8%氯化鈉溶液配制的瓊脂，瓊脂的含量是1%，檢測用抗原為綠膿桿菌脂多糖抗原，抗原含量為150～200mg/ml；18～20g小鼠3只做安全性檢驗，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌苗，觀察7天，無任何異常反應為合格。

2.根據權利要求1所述一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于：在步驟(1)的菌種準備及細菌的增殖中，所述NAC瓊脂培養基的配制方法：按如下所需組分重量稱取，蛋白胨20.0g/L，?硫酸鎂0.2g/L，十六烷基三甲基溴化銨0.2g/L，磷酸氫二鉀0.3g/L，萘啶酮酸0.015g/L，瓊脂12.0g/L，然后將蛋白胨、硫酸鎂、十六烷基三甲基溴化銨、磷酸氫二鉀、萘啶酮酸、瓊脂混合成NAC瓊脂混合物，稱取所述NAC瓊脂混合物33克，加蒸餾水至1000ml，加熱（不用煮沸）直至混合物全部溶解，搖勻，傾注平板，用于假單胞菌屬分離培養；所述LB培養基的配制按如下所需組分重量稱取混合：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂12.0g/L，加700-800ml蒸餾水溶解，然后加蒸餾水補至1000ml，116℃高壓滅菌30分鐘后備用。

3.根據權利要求1或2所述一種抗水貂綠膿桿菌性肺炎獸藥的制備方法，其特征在于：在步驟(2)的制備滅活菌苗中，乳化是指先分別制備油相和制備水相，再按體積比1:3混合乳化，其中：制備油相，取94ml的10號白油，6ml的司本-80，硬脂酸鋁2g，先將硬脂酸鋁與20～30ml白油混合加熱到70～80℃熔化后，再補足剩余10號白油及加入司本-80充分攪拌分裝，在溫度116℃下滅菌30分鐘，最后在10℃冷藏備用；制備水相，取96ml滅活菌抗原懸液，4ml的吐溫-80；乳化按3ml油相和1ml水相配制，取油相加入高速組織搗碎機缸內，在30～50轉/分鐘的慢速下攪拌，緩緩加入水相之后在180～200轉/分鐘的高速下攪拌2～5分鐘，在終止攪拌前加入1%的硫柳汞溶液，使溶液終濃度為萬分之一。