[發(fā)明專利]用于敲低VPS11的小分子干擾RNA、重組載體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310746080.0
• 申請(qǐng)日: 2013-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN103695427B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊詩涵;俞謙;李紅昌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/76;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,熊永強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于敲低VPS11的小分子干擾RNA、重組載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

VPS11蛋白在細(xì)胞囊泡運(yùn)輸過程中起著極其重要的作用，細(xì)胞囊泡運(yùn)輸又是細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕緩街唬匝芯縑PS11蛋白在細(xì)胞囊泡運(yùn)輸中的信號(hào)通路對(duì)研究各項(xiàng)細(xì)胞、組織、器官及生物體生命活動(dòng)都有重要意義的，而研究VPS11在信號(hào)通路中的作用有必要提供一種敲低VPS11的表達(dá)水平的方法以及穩(wěn)定敲低VPS11的表達(dá)水平的細(xì)胞系。

RNA干擾（RNA?interference,RNAi）可誘發(fā)的基因沉默。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，是一種降低目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的有效途徑。

因此，有必要提供一種采用RNA干擾技術(shù)對(duì)VPS11進(jìn)行基因沉默的方法以及一種穩(wěn)定敲低VPS11的表達(dá)水平的細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于敲低VPS11的小分子干擾RNA、shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒和宿主細(xì)胞及應(yīng)用。

本發(fā)明提供的小分子干擾RNA能直接特異性靶向VPS11的mRNA并導(dǎo)致mRNA降解，產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)；本發(fā)明提供的shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒能通過促使宿主細(xì)胞中VPS11的mRNA降解間接地沉默VPS11的表達(dá)，降低VPS11的表達(dá)水平。

本發(fā)明涉及的英文縮寫及其中文釋義如下：

VPS11：所述VPS11蛋白的Genebank登錄號(hào)為NM_021729.4；

mRNA：信使RNA；siRNA：小分子干擾RNA；shRNA：短發(fā)夾RNA；

VPS11-shRNA：具有靶向VPS11蛋白的信使RNA的短發(fā)夾RNA；

第一方面，本發(fā)明提供了一種小分子干擾RNA，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白VPS11的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長度為19～27bp。

優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長度為21～27bp。

優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2所示。

第二方面，本發(fā)明提供了一種shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明第二方面提供了的一種shRNA，為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，所述shRNA具有小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列，其中，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白VPS11的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長度為19～27bp。

優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長度為21～27bp。

優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2所示。

第三方面，本發(fā)明提供了一種shRNA的編碼DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明第三方面提供了的一種shRNA的編碼DNA，所述shRNA具有小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列，其中，所述小分子干擾RNA具有與翻譯突觸融合蛋白VPS11的信使RNA互補(bǔ)的核苷酸序列，長度為19～27bp。

優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長度為21～27bp。

優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2所示。

優(yōu)選地，所述編碼shRNA的DNA的含有SEQ?ID?NO:3或4所示的核苷酸序列。

具體地，在此優(yōu)選條件下，所述SEQ?ID?NO:3（5’-3’）為：

GCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAAACAGC?TTTTT；

所述SEQ?ID?NO:4（5’-3’）為：

AAAAAGCTGTTTAAGAAGAACCTGTTCTCGAGAACAGGTTCTTCTTAA?ACAGC。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述SEQ?ID?NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位點(diǎn)。

更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述SEQ?ID?NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位點(diǎn)分別為AgeⅠ和EcoRⅠ。