[發明專利]一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310744594.2
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103710466A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 戴立忠;吳康;鄧中平;王軍
• 申請（專利權）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;歐穎

技術領域

本發明涉及一種HBV耐藥突變的檢測試劑盒，更具體涉及一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒；其目的是診斷含HBV的樣本是否已經產生YMDD突變，且進一步的，還可定量檢測已產生YMDD突變的HBV病毒比例。

背景技術

乙型肝炎病毒（HBV）簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。據估計，目前全球共有4億慢性乙型肝炎病毒感染患者，我國是乙型肝炎的高發區，既往的流行病學調查結果顯示，我國HBV的感染率為57.63%，乙肝表面抗原（HBsAg）攜帶率為9.75%，我國主要存在的HBV基因型為B型和C型。盡管HBV疫苗的廣泛應用和嬰幼兒計劃免疫項目的推廣對乙肝的預防起到了積極的作用，但HBV的治療仍然是公眾關注的棘手問題。

目前，治療慢性乙型肝炎（CHB）主要是以干擾素和核苷（酸）類似物（NA）等藥物進行抗病毒治療，進而改善肝臟組織學病變。現在臨床應用的主要有拉米夫定（LAM）等核苷類似物治療CHB，類似物治療的主要原理是其作用于HBV-DNA?cccDNA的復制期，抑制前基因組RNA逆轉錄為HBV-DNA的負鏈以及正鏈的合成。由于不能直接作用于感染細胞的病毒cccDNA，所以需要長期用藥來控制病毒復制。但是，長期使用核苷（酸）類似物治療CHB可引起HBV聚合酶基因rt保守區發生點突變，并導致臨床耐藥。HBVYMDD突變的方式主要有兩種：YIDD突變和YVDD突變，即酪氨酸－甲硫氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸（YMDD）中的甲硫氨酸密碼子（M）突變為異亮氨酸（I）和纈氨酸（V）。

隨著分子生物學的飛速發展，越來越多的分子生物學方法應用于檢測HBV耐藥突變，主要包括測序、基因芯片、探針雜交技術等。而隨著FQ-PCR技術的發展，其在HBV突變診斷領域的應用已越來越廣泛，也越來越為人所重視，HBV?YMDD突變的實驗診斷中，實時熒光PCR技術憑借著快速、敏感、特異等優點顯示出了其臨床診斷的優越性。

運用熒光PCR技術檢測HBV?YMDD突變主要包括HBV核酸提取和核酸PCR擴增兩方面。

目前國外臨床上主要采用DNA提取試劑盒來提取HBV核酸，提取效果較好，但是由于價格昂貴，難以在國內應用。

臨床上檢測HBV?YMDD-DNA的方法目前主要是基于實時熒光定量PCR的技術及其改進，實時熒光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與熒光閾值線的交點（即Ct值）以及擴增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考品或標準品，則可以通過軟件自動分析獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定值（即定量檢測）。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，熒光報告基團發出的熒光能量被淬滅基團吸收，呈現淬滅效應；如果擴增過程中有靶序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉移效應，熒光報告基團發出的熒光信號被熒光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。試驗結束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數據，可以獲得陰陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。

國內已有多種基于實時熒光定量PCR技術檢測HBV?YMDD?DNA的試劑盒應用于臨床檢測中。但這些試劑盒所提供的HBV?DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，樣本中的DNA存在損耗，尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低。且這些試劑盒的檢測靈敏度不高，約在500IU左右；還因沒有設置陽性內對照（即內標），無法監控假陰性；和一般沒有預防PCR產物污染的措施。另外，受限于其引物探針序列，本領域還需開發出一種檢測HBV?YMDD?DNA特異性好且綜合性能優良的PCR檢測試劑盒。

發明內容