[發明專利]一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310744594.2
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103710466A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 戴立忠;吳康;鄧中平;王軍
• 申請（專利權）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;歐穎

1.一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒，包括兩種PCR反應液和含磁珠的DNA提取溶液，其中一種PCR反應液中含YIDD上游引物、YIDD下游引物和YIDD探針，另一種PCR反應液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探針，且所述引物和探針的序列為，

YIDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACTGT-3'，

YIDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，

YIDD探針：5'-TTCAGTTATATAGATGATGTG-3'；

YVDD上游引物：5'-TAGGGCTTTCCCCCACT-3'，

YVDD下游引物：5'-ACAGACTTGGCCCCCAAAA-3'，

YVDD探針：5'-CTTTCAGTTATGTGGATGATG-3'。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含內標，且所述兩種PCR反應液中均包含內標上游引物、內標下游引物和內標探針，所述內標序列及其引物和探針的序列為，

內標：5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCAGCTTTTTATTACCTGTGTTGATACTAC?CAGAAGTACCAATTTAACTATTAGCACTGCCACTGCTGCAGTTTCCCCAACATTTACT?CCCAGTAACTTTAAGC-3’；

內標上游引物：5’-ATGGCATTTGCTGGAACAATCA-3’，

內標下游引物：5’-GCTTAAAGTTACTTGGAGTAAATGTTGG-3’，

內標探針：5’-GGAAACCGCAGCAGTGGCAGTG-3’。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括如下組分，

①DNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通和異硫氰酸胍；

②DNA提取溶液Ⅱ：含4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉和100～400μg/ml的磁珠；

③DNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化鈉；

④DNA提取溶液Ⅳ：含礦物油；

⑤DNA洗脫液：含Tris-HCl和EDTA；

⑥內標；

⑦PCR反應液：包括所述的兩種PCR反應液；

⑧酶混合液；

⑨HBV?YMDD陽性對照；

⑩HBV?YMDD陰性對照。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括組分(11)，即用于定量檢測YMDD突變的HBV?YMDD定量參考品。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液中還均包括PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸。

6.一種如權利要求5所述的試劑盒用于檢測HBV的YMDD突變的方法，包括：

步驟1，裂解病毒：向多個離心管均加入組分①，再在不同的離心管中分別加入組分⑨、⑩、(11)和待測樣本，離心；

步驟2，磁珠吸附核酸：向上述每個離心管中均加入組分②+⑥的混合液，并離心和用磁珠分離器進行固液分離，此時離心管壁上的固體含磁珠和DNA；

步驟3，洗滌：去除液體留下固體后，向每個離心管加入組分③和組分④，再經離心和用磁珠分離器進行固液分離，此時離心管壁上的固體含磁珠和DNA；

步驟4，DNA洗脫：去除液體留下固體后，向每個離心管加入組分⑤，將管壁的固體沖洗至管中，且使得磁珠和DNA在組分⑤的作用下洗脫分開，并再離心和用磁珠分離器進行固液分離，此時離心管壁上的固體為磁珠，DNA進入液體中；

步驟5，待熒光PCR分析：將上述離心管中的液體均各自轉移至一個新的離心管中待用；取一定數量的PCR反應管，其中每管均加入組分⑦+⑧，再分別向不同的反應管中加入上述待用的⑨、⑩、(11)和待測樣本；其中也可以先向PCR反應管中加入待用的⑨、⑩、(11)和待測樣本，再向PCR反應管中均加入組分⑦+⑧；蓋好管蓋，用于熒光PCR分析。