[發(fā)明專利]一種乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310744571.1
• 申請(qǐng)日: 2013-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103710465A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴立忠;李勃;劉佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京聿宏知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;歐穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種乙型肝炎病毒基因分型PCR檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

乙型病毒性肝炎，簡(jiǎn)稱乙肝，是一種由乙型肝炎病毒（HBV）感染機(jī)體后所引起的疾病。乙型肝炎病毒是一種嗜肝病毒，主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)并損害肝細(xì)胞，引起肝細(xì)胞炎癥、壞死、纖維化。乙型病毒性肝炎分急性和慢性兩種。急性乙型肝炎在成年人中90%可自愈，而慢性乙型肝炎表現(xiàn)不一，分為慢性乙肝攜帶者、慢性活動(dòng)性乙型肝炎、乙肝肝硬化等。全球約20億人曾感染過(guò)HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌（HCC）。我國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)，乙肝病毒攜帶率為總?cè)藬?shù)的10%左右，每年新發(fā)病人約900萬(wàn)人。目前，依據(jù)核苷酸序列異源性≥8%或S基因序列異質(zhì)性≥4%可將HBV?DNA分為A～I(xiàn)共9個(gè)基因型。HBV基因型的分布具有一定的地理流行病學(xué)特征，通過(guò)研究不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)基因型可以反映出該地區(qū)HBV自然感染史發(fā)生的變異特點(diǎn)，這是由病毒變異后進(jìn)化所導(dǎo)致的結(jié)果。在中國(guó)的HBV基因型是以B、C和D這3型為優(yōu)勢(shì)基因型，并以C型最多。

不同HBV基因型可以導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)及預(yù)后。有研究表明基因D型HBV感染者更易發(fā)生肝衰竭，且基因D型更易引起慢性乙型肝炎病情的復(fù)發(fā)；基因B型感染者較C型感染者較少發(fā)生肝損害，且基因B型感染者較C型不易發(fā)展至肝硬化、炎癥程度較輕、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換更早。基因C型感染者其肝臟炎癥壞死評(píng)分高于基因B型感染者。另有研究顯示，基因C型HBV感染者較B型感染者更易發(fā)展為肝硬化和肝癌（HCC）。此外，C型較之B型更易發(fā)生核心啟動(dòng)子（BCP）區(qū)域的變異，可能導(dǎo)致臨床上表現(xiàn)為HBeAg陰性的慢性乙型肝炎。

不同基因型HBV感染對(duì)抗病毒的反應(yīng)不同。HBV感染對(duì)于擾素治療的有效性在病毒分子學(xué)方面的因素仍有許多是未知的。干擾素治療的費(fèi)用昂貴，需注射，并且有較多不良反應(yīng)以致患者較難耐受。因此在臨床上預(yù)測(cè)干擾素治療的有效性是非常重要的。目前普遍認(rèn)為，在HBeAg陽(yáng)性慢性乙肝患者中，基因B型患者對(duì)于干擾素的應(yīng)答率高于基因C型患者，且在HBeAg清除方面基因B型高于基因C型。目前，在歐洲肝病協(xié)會(huì)最新版本的HBV防治指南里已經(jīng)明確指出，在經(jīng)干擾素治療后，A型與B型有著比C型與D型更高的應(yīng)答率。

因此，HBV基因分型檢測(cè)可以在乙型肝炎患者的臨床類型、預(yù)后判斷及治療方法的選擇等方面發(fā)揮重要的作用。

目前HBV基因分型的主要實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)是基于核酸檢測(cè)的分子生物方法。主要有全基因測(cè)序分析、線性探針?lè)聪螂s交、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）、基因芯片、反向斑點(diǎn)雜交以及熒光PCR法等。測(cè)序技術(shù)雖然結(jié)果可靠準(zhǔn)確，但是由于其技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)流程長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件要求高、耗時(shí)長(zhǎng)和費(fèi)用昂貴難以用作臨床常規(guī)使用；RFLP技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，但是酶切位點(diǎn)易受基因變異的影響，且遇混合感染或酶切不完全，會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜條帶，影響分型結(jié)果的判斷；其它雜交、芯片類等需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析的方法相對(duì)來(lái)說(shuō)均存在較易污染的弊端。熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性高，特異性好，且整個(gè)過(guò)程中避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染。

結(jié)合國(guó)內(nèi)情況，在HBV基因分型的實(shí)驗(yàn)診斷中，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)憑借著快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性，目前已有多家熒光PCR診斷試劑盒在臨床HBV基因分型診斷中常規(guī)使用，但是缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。

運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。

目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對(duì)乙型肝炎病毒的核酸進(jìn)行提?。合葘⒎置谖飿颖緷饪s、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板。對(duì)于濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無(wú)法看到，看得到沉淀的是因?yàn)閷⒉《九c蛋白都濃縮了，這樣，導(dǎo)致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無(wú)法看到沉淀，使操作者無(wú)法確定吸棄上清時(shí)會(huì)不會(huì)吹打到病毒核酸。