[發(fā)明專利]一種蜂蜜中氨基酸的測定方法

有效

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• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN103713078A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 陳志燕;范忠;孟冬玲;田兆福;李小蘭;徐雪芹
• 申請（專利權）人: 廣西中煙工業(yè)有限責任公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/34;G01N30/06
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 李紅團

技術領域

本發(fā)明屬于理化檢驗技術領域，具體涉及蜂蜜中氨基酸含量的測定方法。

背景技術

氨基酸是蛋白質的基本組成單位，也是生物體的主要組成物質。氨基酸分析在工業(yè)、醫(yī)藥、農業(yè)生產、食品加工及生命科學研究中十分重要。蜂蜜中氨基酸是蜂蜜的主要營養(yǎng)成分，不同產地不同花型的蜂蜜的氨基酸種類和含量差異很大，分析蜂蜜中氨基酸種類和含量對研究蜂蜜的營養(yǎng)價值具有重要的意義。有關蜂蜜中氨基酸的檢測標準和方法較少,與國際標準差距很大,因此加強檢測方法和標準的研究勢在必行。目前蜂蜜中氨基酸的測定多采用柱前衍生高效液相色譜法和氨基酸分析儀測定法。這些方法大多需要利用衍生化反應才能進行檢測，存在衍生試劑有毒、易見光分解、衍生洗脫后定量困難的問題，而本發(fā)明采用稀鹽酸超聲提取，過濾膜后直接進入高效液相串聯質譜儀進行檢測，可減少了氨基酸柱前衍生反應的前處理時間，消除交叉污染，減少樣品損失。

發(fā)明內容

本發(fā)明克服現有技術的不足，提供一種新的蜂蜜中氨基酸含量的測定方法。

本發(fā)明的技術方案是提供一種蜂蜜中氨基酸含量的測定方法，其特征在于包括以下步驟：

萃取液的制備：用0.03mol/L的HCl溶解定量的L-正纈氨酸，制備成含2μmol/L?L-正纈氨酸的0.03mol/L的HCl溶液，作為萃取液。

標準工作溶液制備：用上述萃取液為溶劑，將17種氨基酸混標Ⅰ（脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、精氨酸（Arg）、胱氨酸（Cys）、組氨酸（His）、甲硫氨基酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）250pmoL/μL和4種氨基酸混合標準儲備液Ⅱ（天冬酰胺（Asn）、色氨酸(Trp)、谷氨酰胺（Gln）、羥脯氨酸(Hpro)，濃度為100μmol/L）配成不同系列濃度的標準溶液。進行高效液相－串聯質譜檢測；然后以被測物的峰面積與其內標的峰面積的比值（Y）對被測物的濃度（X）進行線性回歸，求得各氨基酸的標準曲線；

（2）樣品制備和分析：準確稱取0.5g待測蜂蜜樣品，放入50mL磨口三角瓶中，準確加入25mL萃取液，超聲15min，取出后搖蕩錐形瓶片刻使其混合均勻，經0.22μm濾膜過濾后進行高效液相－串聯質譜分析；

（3）色譜分離條件：色譜柱：Agilent?ZORBAX?Eclipse?AAA色譜柱，Agilent?ZORBAX?Eclipse?AAA預柱；流速：0.6mL/min；柱溫：40℃；進樣量：5μL；流動相A：乙腈，流動相B：0.1﹪甲酸，梯度洗脫條件如下

（4）離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：5000V；離子源溫度：350℃；輔助氣Gas1壓力：60psi；輔助氣Gas2壓力：50psi；去簇電壓(DP)：18V。

（5）數據處理與檢測：由組分峰面積與內標峰面積之比進行內標法定量。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：適合于蜂蜜中氨基酸的測定，該方法能快速、準確檢測蜂蜜中21中氨基酸的含量，測定過程干擾少，檢測結果準確。

本發(fā)明的方法克服了現有技術樣品處理方法的不足，針對蜂蜜樣品的基質優(yōu)化了流動相梯度程序，簡化了樣品前處理。與現有技術相比本發(fā)明具有以下效果：

1、與傳統(tǒng)的柱前衍生前處理比較，直接進樣，樣品待測物質損失少，實驗過程不使用有毒有害化學品，對操作人員危害小，易于操作。

2、采用0.1%的甲酸流動相消除了干擾。

3、采用優(yōu)化的梯度洗脫程序，回收率高，測定結果準確。

4、本方法具有操作簡便、快速、準確、靈敏度及重復性好的優(yōu)點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明方法的測定流程圖；

圖2是甘氨酸（Gly）的提取離子流圖；

圖3是丙氨酸（Ala）的提取離子流圖；

圖4是絲氨酸（Ser）的提取離子流圖；

圖5是脯氨酸(Pro)的提取離子流圖；

圖6是纈氨酸（Val）和內標（nVal）的提取離子流圖；

圖7是蘇氨酸（Thr）的提取離子流圖；

圖8是異亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)的提取離子流圖；

圖9是羥脯氨酸(Hpro)的提取離子流圖；