[發(fā)明專利]用于從標(biāo)本中對(duì)百日咳鮑特菌紅霉素耐藥性進(jìn)行快速檢測(cè)的引物及檢測(cè)方法

無(wú)效

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• 申請(qǐng)日: 2013-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103667512A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王增國(guó);侯鐵軍;杜全麗;劉瑩;習(xí)艷麗;李恒新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標(biāo)代理有限公司 61211
• 代理人: 姚敏杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種致病菌的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，尤其涉及一種不依賴病原菌分離培養(yǎng)的，用于從標(biāo)本中對(duì)百日咳鮑特菌的紅霉素耐藥性進(jìn)行快速檢測(cè)的引物及檢測(cè)方法。

技術(shù)背景

百日咳是一種由百日咳鮑特菌感染引起的傳染病，人群各個(gè)年齡均可感染。百日咳鮑特菌是一種革蘭陰性桿菌，體外培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求較高，為專性需氧的一種苛養(yǎng)菌。臨床上報(bào)道的百日咳鮑特菌分離培養(yǎng)率極低，甚至可低于10%，且出具報(bào)告所需時(shí)間較長(zhǎng)（7天-10天）；而我國(guó)的多數(shù)研究中，所報(bào)道的百日咳鮑特菌分離培養(yǎng)率為“零”。研究認(rèn)為，在一些疫苗高覆蓋率國(guó)家，百日咳的發(fā)病隨著疫苗的高覆蓋率出現(xiàn)了大大降低，而近年來(lái)，百日咳的發(fā)病卻呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，這一現(xiàn)象稱為“百日咳重現(xiàn)”。

紅霉素是治療百日咳感染和密切接觸者預(yù)防服藥的首選抗生素。而常規(guī)檢測(cè)百日咳鮑特菌的抗生素敏感試驗(yàn)需要有成功的臨床標(biāo)本百日咳鮑特菌分離培養(yǎng)才能完成。但由于百日咳鮑特菌生長(zhǎng)較為緩慢，即使有可用于抗生素敏感試驗(yàn)的臨床菌株，完成百日咳鮑特菌抗生素敏感性試驗(yàn)也需要數(shù)日的時(shí)間。

全球首例紅霉素耐藥百日咳鮑特菌最早于1994年發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，之后美國(guó)，法國(guó)和我國(guó)相繼都陸續(xù)有個(gè)別相關(guān)報(bào)道，而我國(guó)近年來(lái)共有6例成功的百日咳鮑特菌分離培養(yǎng)的報(bào)道，而且所有6株細(xì)菌都表現(xiàn)為紅霉素耐藥。提示和其它國(guó)家不同，我國(guó)的紅霉素或大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥百日咳鮑特菌感染可能較為普遍。

當(dāng)前的研究表明，百日咳鮑特菌紅霉素耐藥現(xiàn)象與其基因組23S?rRNA基因Ⅴ區(qū)中的一個(gè)核苷酸位點(diǎn)突變有關(guān)，即A2047G。之后的多篇報(bào)道都證實(shí)了發(fā)生紅霉素或大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的百日咳鮑特菌中，均發(fā)現(xiàn)有23S?rRNA基因的A2047G突變發(fā)生。

而目前所有發(fā)表的文獻(xiàn)中關(guān)于百日咳鮑特菌紅霉素耐藥性檢測(cè)的方法包括以下兩類（1）常規(guī)的瓊脂稀釋法、紙片擴(kuò)散法和E-test法；（2）對(duì)百日咳鮑特菌23S?rRNA基因Ⅴ區(qū)的PCR擴(kuò)增，并通過(guò)測(cè)序、限制性片段酶切后電泳觀察以及高分辨率溶解曲線技術(shù)分析。

而以上百日咳鮑特菌紅霉素耐藥性檢測(cè)所使用的方法均有一個(gè)最大的缺陷，即必須獲得百日咳鮑特菌菌株才能完成，而百日咳鮑特菌極低的分離培養(yǎng)率往往導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)無(wú)法完成。

而23S?rRNA基因在細(xì)菌菌屬間是具有一定的保守性，也常作為一些細(xì)菌的分子鑒定的靶基因，因此從混合有其它未知核酸的標(biāo)本中直接檢測(cè)該基因具有一定的理論可行性。因此，特異性PCR的關(guān)鍵是特異性引物的設(shè)計(jì)。而成功的特異性PCR擴(kuò)增后，針對(duì)其紅霉素耐藥的分子機(jī)制所做的后續(xù)檢測(cè)，則可直接快速的判斷標(biāo)本中的百日咳鮑特菌的紅霉素耐藥性。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決背景技術(shù)中存在的百日咳鮑特菌無(wú)法成功培養(yǎng)導(dǎo)致其其抗生素敏感試驗(yàn)無(wú)法開(kāi)展，且其抗生素敏感試驗(yàn)的開(kāi)展較為耗時(shí)等技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種可直接快速的對(duì)標(biāo)本中所感染的百日咳鮑特菌的紅霉素耐藥性進(jìn)行檢測(cè)的引物和檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：本發(fā)明提供了一種用于從標(biāo)本中對(duì)所感染的百日咳鮑特菌的紅霉素耐藥性進(jìn)行快速檢測(cè)的引物，其特殊之處在于：所述引物針對(duì)百日咳鮑特菌23S?rRNA基因包括2047位點(diǎn)兩側(cè)的可變區(qū)域。

上述引物的核苷酸序列是：

1505F:5’-GGCACGAGCGAGCAAGTCTC-3’，以及

2118R:5’-TCTGGCGACTCGAGTTCTGC-3’。

一種基于如上所述的引物的對(duì)百日咳鮑特菌紅霉素耐藥性進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特殊之處在于：所述方法包括以下步驟：

1）采集百日咳鮑特菌核酸陽(yáng)性標(biāo)本；

2）采用如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)步驟1）所得到的百日咳鮑特菌核酸陽(yáng)性標(biāo)本的23S?rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增結(jié)果；

3）對(duì)步驟2）所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并根據(jù)電泳結(jié)果初步判斷是否擴(kuò)增到百日咳鮑特菌23S?rRNA基因。

上述步驟3）之后還包括：

4）對(duì)步驟2）得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果；

5）根據(jù)步驟4）所得到的測(cè)序結(jié)果與野生型百日咳鮑特菌進(jìn)行比對(duì)，確定步驟1）所采集得到的百日咳鮑特菌核酸陽(yáng)性標(biāo)本是否含有對(duì)紅霉素耐藥的百日咳鮑特菌。

上述步驟1）的具體實(shí)現(xiàn)方式是：

1.1）采集臨床百日咳疑似病例的鼻咽拭子標(biāo)本；

1.2）將步驟1.1）所采集得到的臨床百日咳疑似病例的鼻咽拭子標(biāo)本放置于0.5ml生理鹽水中并提取DNA；