[發明專利]一種酶解法制備蜂王胚胎肽的方法

有效

• 申請號: 201310743207.3
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103725742A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 趙樹民;石松傳;鮑勇剛
• 申請（專利權）人: 趙樹民;于利
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種酶解法制備蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，包括：

步驟1：樣品預處理：將蜂王幼蟲在存活期內-80℃迅速冷凍，并干燥，將干燥的蜂王幼蟲樣品研磨成粉；

步驟2：蜂王幼蟲粉末脫脂：將預處理過的蜂王幼蟲粉末樣品放入超臨界萃取裝置脫脂，脫脂條件：萃取壓力35MPa，萃取溫度35℃，萃取時間200分鐘，常壓分離，收集脫脂后的蜂王幼蟲蛋白用于進行酶解；

步驟3：蜂王幼蟲粉樣品液配制：以上述脫脂后的蜂王幼蟲粉為原料，該原料中蛋白質的含量為在70％以上，將該蜂王幼蟲粉原料按照料液比1∶10(w／v)加入去離子水50℃攪拌混勻4小時，獲得蜂王幼蟲粉樣品液；

步驟4：超聲波處理蜂王幼蟲粉樣品液：使用功率250W～1250W的脈沖超聲波進行對蜂王幼蟲粉樣品液預處理，超聲波處理時間30分鐘，對應一個脈沖的超聲波發出時間2～4s、間隙時間2s；

步驟5：蜂王幼蟲粉樣品液酶解反應：將超聲波處理后的脫脂蜂王幼蟲粉樣品液pH調至7.5～8.5，在恒溫水浴中加熱至40℃～60℃，按照酶與脫脂蜂王幼蟲粉樣品液質量比例0.02～0.04∶1加入復合蛋白酶，所述復合蛋白酶由中性蛋白酶和風味蛋白酶按照質量比例1∶1組成，水解度達到20％時停止反應；

步驟6：將酶解液置于沸水浴中加熱20分鐘滅酶，冷卻至常溫，將酶解液pH值調至7.0，離心后取上清液；

步驟7：干燥上述上清液獲得水解的蜂王胚胎肽粉。

2.根據權利要求1所述的酶解法制備蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，所述蜂王幼蟲為2～3日齡的蜂王幼蟲。

3.一種用于測定權利要求1酶解法制備的蜂王胚胎肽中多肽含量測定方法，其特征在于，利用10％三氯乙酸(TCA)沉淀水解液中大分子蛋白，經過離心過濾后，在上清液中加入雙縮脲試劑，于540nm測定其OD值，繼而配制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準溶液，測定標準肽數據，制作標準曲線，在曲線上查找樣品中的多肽含量。

4.一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，包括自由基清除能力測定、超氧陰離子自由基清除能力測定和脂質體過氧化抑制能力測定。

5.根據權利要求4所述的一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述自由基清除能力測定為測定水解蜂王胚胎肽酶解物樣品溶液對DPPH自由基的清除除力。

6.根據權利要求4所述的一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述超氧陰離子自由基清除能力測定采用核黃素-光-氮藍四唑體系測定。

7.根據權利要求4所述的一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述脂質體過氧化抑制能力測定方法是，在10m試管中加入0.2ml脂質體溶液，不同體積的樣品和50mmol／L?FeSO4溶液50ul，再加入磷酸鹽緩沖溶液至3mL不加樣品的反應物管作為模型，不加FeSO4溶液的試管作為空白，將反應物置于37℃水浴40分鐘，最后加入10％三氯乙酸1ml，0.8％硫代巴比妥酸(TBA)1ml，混合均勻，置于沸水中15分鐘，冰水冷卻，在8000r／min下離心10分鐘，取上清液在532nm處測定吸光度(A)，按照以下計算公式計算脂質過氧化的抑制率：脂質過氧化的抑制率(％)=(A模型一A樣品)／(A模型一A空白)×100％。