[發(fā)明專利]一種利用焦磷酸測序技術檢測小反芻獸疫疫苗毒的試劑盒

有效

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• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103695565A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設計）人: 王彩霞;林祥梅;吳紹強;張永寧;馮春燕
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發(fā)明涉及焦磷酸測序技術，特別是涉及利用焦磷酸測序技術檢測小反芻獸疫疫苗毒的試劑盒。

背景技術

小反芻獸疫(Peste?des?petits?ruminants，PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒（PPRV）引起的一種高度接觸性動物疫病。該病主要感染家養(yǎng)和野生小反芻獸，山羊尤其易感，其致病性與分子學特性與牛瘟（RP）非常相似，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE)規(guī)定為A類動物疫病，給發(fā)生該病的國家，尤其是非洲、中東、近東和南亞等國家的外貿(mào)經(jīng)濟帶來了巨大的損失。該病自發(fā)生以來，不斷向世界各地蔓延，對無該病發(fā)生的國家，尤其對呈地方性流行國家的臨近國家造成的威脅逐漸加大，2007年，我國首次在西藏發(fā)生PPR。由于目前對小反芻獸疫缺乏有效的治療方法，我國的PPR防治主要依賴疫苗的免疫，PPR弱毒疫苗的廣泛使用雖然對我國疫情的防控作用顯著，但使用疫苗大規(guī)模免疫小反芻動物后，將面臨血清學上疫苗株對強毒株診斷的干擾問題。近幾年來，應用PCR，RT-PCR，ELISA等方法對PPRV進行診斷并排除牛瘟病毒（RPV）干擾的報道屢見不鮮，但鮮有報道鑒別檢測PPRV疫苗株與強毒株的方法。

焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）是近幾年發(fā)展起來的一種能夠進行定量序列測定的新技術，具有高通量、快速、敏感等特點。目前該技術在物種鑒定、病毒的快速鑒定和分型、微生物的檢測以及寄生蟲檢測鑒定等方面已有廣泛的應用。

焦磷酸測序是不同于Sanger法的一種新的測序技術，它以單鏈DNA為模板，在熒光素、5′-磷酸化硫酸腺苷（APS）等底物存在，及DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸酶（ATP?sulfurylase）、重組熒光素酶（luciferase）催化下，加入與模板互補的dNTP時發(fā)生延伸反應，產(chǎn)生與模板堿基數(shù)相應強度的熒光信號，不互補的dNTP被三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）降解，無熒光信號產(chǎn)生。焦測序無需熒光染料標記和電泳步驟，能夠在短時間內(nèi)提供基因片段的序列信息，是短片段基因測序的理想平臺。焦測序技術已經(jīng)在SNP檢測，微生物分型，基因甲基化檢測等領域得到應用，還應用到大規(guī)模DNA測序中，使測序技術發(fā)生了革命性變化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測技術的不足，提供一種小反芻獸疫疫苗毒特異焦磷酸測序檢測方法，以彌補現(xiàn)有檢測技術的不足，為我國畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)、畜產(chǎn)品加工和出口商以及國際畜產(chǎn)品貿(mào)易等方面提供一種快速、簡便、高效、實用的檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的主要原理是利用焦磷酸測序技術，通過DNA聚合酶（DNA?ploymerase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP?sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）和雙磷酸酶（apyrase）4種酶催化待測序DNA單鏈和測序引物的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，反應底物為5’-鄰酰硫酸（adenosine5’phosphosulfate，APS）和熒光素。在每一輪測序反應中，加入1種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團（PPi）。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，光信號由CCD攝像機檢測并由Pyrogram^TM反應為峰，每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應體系。然后加入下一種dNTP。最終待測序列順序即可從反應光強的信號峰中讀出。

本發(fā)明的另一目的在于提供用于檢測小反芻獸疫疫苗毒的試劑盒。

本發(fā)明首先提供的一種適用于焦磷酸測序檢測小反芻獸疫疫苗毒N基因的特異目標序列，其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明提供了用于檢測小反芻獸疫疫苗毒N基因的特異性引物，其核苷酸序列為：

SPPRVF：5’-ACAGACTGGGGATGAACGAA-3’

SPPRVR：5’-Biotin-GGCTTTCCTGAGCGTGTTC-3’。

本發(fā)明提供了與上述特異性引物配合使用的焦磷酸測序引物，其核苷酸序列為：

SPPRVS：5’-AAACAGATGAGGGAGAGT-3’。