[發(fā)明專利]一種利用焦磷酸測序技術(shù)檢測小反芻獸疫疫苗毒的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310741946.9
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103695565A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王彩霞;林祥梅;吳紹強;張永寧;馮春燕
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種適用于焦磷酸測序檢測小反芻獸疫疫苗毒N基因的特異目標(biāo)序列，其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

2.用于檢測小反芻獸疫疫苗毒N基因的特異性引物，其核苷酸序列為：

SPPRVF：5’-ACAGACTGGGGATGAACGAA-3’

SPPRVR：5’-Biotin-GGCTTTCCTGAGCGTGTTC-3’。

3.與權(quán)利要求2所述特異性引物配合使用的焦磷酸測序引物，其核苷酸序列為：

SPPRVS：5’-AAACAGATGAGGGAGAGT-3’。

4.一種利用焦磷酸測序技術(shù)檢測小反芻獸疫疫苗毒的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的特異性引物和權(quán)利要求3所述的焦磷酸測序引物。

5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其工作程序為：

（1）提取待測樣品的RNA；以權(quán)利要求2所述的特異性引物進行RT-PCR擴增；

（2）若擴增產(chǎn)物長度為180bp，則制備焦磷酸測序單鏈模板；

（3）進行焦磷酸測序，若目的序列與權(quán)利要求1所述特異目標(biāo)序列一致，則待測樣品中含有小反芻獸疫疫苗毒。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟（1）的RT-PCR50μL反應(yīng)體系中含10×One?Step?RNA?PCR?Buffer5μL，MgCL₂25mmol/L，10μL，dNTP?Mixture各10mmol/L5μL，40U/μL?RNA酶抑制劑1μL，5U/μL?AMV反轉(zhuǎn)錄酶XL1μL，5U/μL?AMV-Optimized?Taq1μL，10pmol/μL上、下游引物各1.0μL，待測RNA1μg，無RNA酶H₂O補足50μL反應(yīng)體系。

7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟（1）的RT-PCR擴增條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性2min后；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)50次；然后72℃再延伸8min。

8.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟（1）中RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測方法為取0.6g瓊脂糖，于30mL1×TAE電泳緩沖液中加熱，充分熔化，加入SYBR?Green10000倍稀釋的溶液2μL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；取5μLRT-PCR擴增產(chǎn)物分別和1μL6×Loading?Buffer混合后，點樣；10V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部，停止電泳，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并記錄。

9.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟（2）的制備焦磷酸測序單鏈模板方法為：使用20μL標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與30μL?ddH₂O混合后再與200μg鏈霉素親和素包被的磁珠混合，室溫下置震蕩器上1400rpm震蕩孵育15min，用真空吸附泵將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起，然后依次通過70%乙醇5s；變性緩沖液5s；沖洗緩沖液5s，最后移至預(yù)先每孔加入含有0.3mol/L測序引物的結(jié)合緩沖液的96孔板上方，釋放磁珠，將96孔板放入80℃烘箱中加熱2min后，取出冷卻至室溫。

10.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟（3）焦磷酸測序反應(yīng)在20-28℃下于焦磷酸測序儀上進行檢測，所采用的堿基加入順序為15（ATGC），每輪測序檢測運行時間為65min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨著核酸的結(jié)合，CCD攝像機檢測到發(fā)出的光信號，讀出DNA序列。