[發(fā)明專利]一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體、構(gòu)建方法、重組工程菌及其表達(dá)方法

有效

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• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN103725706A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊國慶;姚雅楠
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體，同時(shí)還涉及該重組載體的構(gòu)建方法，包含該重組載體的重組工程菌及其表達(dá)豬腸三葉肽的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個(gè)體系可以實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主中表達(dá)的目的。一般由以下幾個(gè)部分組成：（1）宿主：表達(dá)蛋白的生物體。可以為細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達(dá)蛋白的種類也不相同。（2）載體：載體的種類與宿主相匹配。根據(jù)宿主不同，分為原核（細(xì)菌）表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、植物表達(dá)載體、哺乳動(dòng)物表達(dá)載體、昆蟲表達(dá)載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導(dǎo)，外源基因可以在宿主中表達(dá)。（3）輔助成分：有的表達(dá)系統(tǒng)中還包括了協(xié)助載體進(jìn)入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達(dá)體系中的桿狀病毒。其中，原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)既是最常用的表達(dá)系統(tǒng)，也是最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌（E.coli）表達(dá)系統(tǒng)為代表，其最早被采用進(jìn)行研究的，是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，也是生產(chǎn)重組蛋白的最常用的系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、細(xì)胞繁殖快速、誘導(dǎo)表達(dá)相對簡便、成本低、表達(dá)量高和表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)主要是蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機(jī)制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。對于表達(dá)不同的蛋白，需要采用不同的表達(dá)載體。表達(dá)載體質(zhì)粒上的元件包括：啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、終止密碼、復(fù)制子、篩選標(biāo)記或報(bào)告基因等。目前已知的大腸桿菌的表達(dá)載體可分為非融合型表達(dá)載體和融合型表達(dá)載體兩種。非融合表達(dá)是將外源基因插到表達(dá)載體強(qiáng)啟動(dòng)子和有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列下游，以外源基因mRNA的AUG為起始翻譯，表達(dá)產(chǎn)物在序列上與天然的目的蛋白一致。融合表達(dá)是將目的蛋白或多肽與另一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽片段的DNA序列融合并在菌體內(nèi)表達(dá)。融合型表達(dá)的載體包括分泌表達(dá)載體、帶純化標(biāo)簽的表達(dá)載體、表面呈現(xiàn)表達(dá)載體、帶伴侶的表達(dá)載體。

近幾年來，國內(nèi)外大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的重點(diǎn)已從構(gòu)建各種表達(dá)載體，建立新的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中還存在的缺陷等方面。這些研究工作主要包括重組蛋白質(zhì)的正確折疊，構(gòu)象形成和分泌，菌體表面表達(dá)技術(shù)及其應(yīng)用，重組蛋白質(zhì)修飾加工研究等內(nèi)容。

值得重視的是，在大腸桿菌中表達(dá)的目標(biāo)基因往往會(huì)形成不溶性、無活性的包涵體，這使大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍受到了很大限制，雖然到目前為止大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)問題還沒有完全解決，但也取得了不少研究結(jié)果和進(jìn)展。包涵體是由于在新合成的大量目標(biāo)蛋白質(zhì)的折疊過程中，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)參與折疊的蛋白因子的量不能滿足需要，無法形成正確的構(gòu)象而產(chǎn)生的。由于大腸桿菌本身的蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工體系相當(dāng)不完善，因此不能對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾加工，這是大腸桿菌系統(tǒng)與其它表達(dá)系統(tǒng)相比存在的一個(gè)比較突出的缺陷。因此關(guān)于表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)象、分泌、定位和修飾加工研究是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的重點(diǎn)方向。

腸三葉肽TFF3是三葉肽家族中最重要的小分子多肽，又稱為腸三葉因子（ITF），主要分布于腸道。它由59個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約6.7KDa，屬于三葉肽家族，由于具有特殊的“三葉草”空間結(jié)構(gòu)，不僅能促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞的增殖，還能與腸粘液中的糖蛋白發(fā)生結(jié)合，起到穩(wěn)定腸粘液和維護(hù)腸粘液屏障的作用，因而其在腸道損害修復(fù)以及再生方面具有非常重要的意義。腸三葉肽TFF3是一種具有重要的潛在藥用價(jià)值的小蛋白分子，因此采用基因工程的方法獲取TFF3，對腸三葉肽的研究并加以有效地利用就有非常重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體，采用該表達(dá)載體的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)可溶性豬腸三葉肽。

本發(fā)明的目的還在于提供一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的目的還在于提供一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體的重組工程菌。

本發(fā)明的目的還在于提供一種利用重組工程菌誘導(dǎo)表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體，將人半乳糖凝集素1和豬腸三葉肽的基因插入表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建而成。

所述的表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體包括如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。