[發(fā)明專利]一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體、構(gòu)建方法、重組工程菌及其表達(dá)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310739492.1
• 申請(qǐng)日: 2013-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN103725706A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊國(guó)慶;姚雅楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體，其特征在于，將人半乳糖凝集素1和豬腸三葉肽的基因插入表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建而成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體，其特征在于，包括如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

3.一種表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）提取豬腸道黏膜總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物Primer?F、Primer?R，擴(kuò)增豬腸三葉肽TFF3基因；

2）以人cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物Primer?a、Primer?b，擴(kuò)增人半乳糖凝集素1基因片段；將擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pMD-19T酶切，連接過夜，得到重組質(zhì)粒pMD19T-Galectin-1；

3）將重組質(zhì)粒pMD19T-Galectin-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落，然后提取陽性菌落中的重組質(zhì)粒pMD19T-Galectin-1并酶切，回收酶切產(chǎn)物；

4）將酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒pET28a雙酶切，并連接過夜，得到重組質(zhì)粒pET28a-Galectin-1；隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取大腸桿菌DH5α菌落培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選陽性菌落；

5）培養(yǎng)步驟4）的陽性菌落，提取質(zhì)粒pET28a-Galectin-1；

6）以質(zhì)粒pET28a-Galectin-1為模板，設(shè)計(jì)引物Primer?F1、Primer?R2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

7）以步驟6）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)引物Primer?F1、Primer?R3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

8）以步驟7）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)引物Primer?F1、Primer?R4，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

9）將步驟8）的擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；然后挑取大腸桿菌DH5α菌落培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選陽性克隆；

10）提取步驟9）陽性菌落的質(zhì)粒，然后與步驟1）的豬腸三葉肽TFF3基因雙酶切，并連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，大腸桿菌DH5α陽性克隆中的質(zhì)粒即為表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物Primer?F、Primer?R為：

Primer?F：5’-GTCCCAGCCAAGCTTGGGGAGTATGTGGGCCTGTCG-3’；

Primer?R：5’-GTCCAAGCCCTCGAGTCAGAAGGTGCATTCTGTTTC-3’。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物Primer?a、Primer?b為：

Primer?a：5’-CGCGGATCCGCTTGTGGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAATCTC-3’

Primer?b：5’-CGCCCCAAGCTTGGGTCAGTCAAAGGCCACACATTTGATCTTGAAGTC-3’。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物Primer?F1、Primer?R2為：

Primer?F1：5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’

Primer?R2：5’-ACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGCCACACATTT-3’。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)可溶性豬腸三葉肽的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述引物Primer?F1、Primer?R3為：

Primer?F1：5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’

Primer?R3：5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGC-3’。