[發明專利]海帶配子體低溫冷凍保存方法

有效

• 申請號: 201310738266.1
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103725641A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 羅世菊;錢瑞;武瑞娜;李言;賽珊;王利芹;趙聚萍;崔翠菊;李曉捷;李霞
• 申請（專利權）人: 山東東方海洋科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01N3/00
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 鄭自群

技術領域

本發明涉及大型經濟藻類低溫冷凍保存方法，具體涉及一種海帶配子體低溫冷凍保存方法，屬于海洋生物技術領域。

背景技術

海帶是我國海水養殖的重要經濟藻類之一，在海帶的生活史中出現孢子體和配子體兩種獨立生活的藻體，它們在外形和大小上有明顯差別，通常我們所見的是孢子體，分為葉片、柄和固著器，而配子體微小，在顯微鏡下可見，雌、雄配子體是由單個或多個細胞組成的藻體，將單個配子體取出，給予一定的溫度光照條件，單個配子體細胞能進行細胞分裂，形成無性繁殖系，即克隆。配子體克隆技術的建立為海帶的種質保護奠定了基礎。

海帶的種質保存傳統方法是在低溫弱光條件下進行配子體的液相培養保存，2005年山東東方海洋科技股份有限公司與煙臺大學共同開發了海帶配子體固相保存技術及超低溫（-196℃）液氮冷凍保存技術，使海帶的種質保存技術體系得到進一步完善。

但從操作難易程度、工作量、是否容易導致污染、成本消耗、種質保存的永久性等諸多因素考慮，任何一種保存技術均存在一定的局限性或不足。

常規液相保存一般15-30天需更換培養液，長期頻繁的繼代培養可能引起遺傳性狀的改變，工作量大，種質污染、混雜機會相應增加，并且所需的培養液需煮沸后冷卻的海水進行配制，能源消耗大，成本高；固相培養保存可大大延長培養基的更換周期，在低溫弱光條件下1年甚至2-3年不用更換固體培養基，僅在固體培養基表面添加適量培養液即可滿足配子體的保存需要，固相培養克服了液相培養頻繁更換培養液的不足，但固相培養前期的藥敏實驗、抑菌濃度梯度實驗、大量培養基的制備使接種前期工作量大增；-196℃液氮冷凍保存可使配子體的代謝完全停止，可實現配子體的永久保存，液氮冷凍保存有程序降溫法、逐級冷凍法及包埋脫水法三種方法，其中程序降溫法對儀器設備要求高，成本高；逐級冷凍保存法不需昂貴的儀器設備，在液氮面以上2cm處預凍30min再入液氮；包埋脫水法不需使用抗凍保護劑和昂貴的程序降溫儀，凍存材料的脫水速率是凍存成功的一個關鍵，對脫水環境的溫度、濕度要求較高，并非脫水率達到要求，就能保證凍存成功；這三種方法最終都是在液氮中進行保存，液氮凍存需定期向液氮罐添加液氮，后續成本增大，若夏季進行海帶配子體克隆系的保存，環境氣溫很高，液氮罐的頻繁開啟，極易造成液氮的大量揮發，此期液氮消耗更大，一旦液氮得不到及時補充，凍存的材料露出液氮面，將導致凍存失敗，采集的種質得不到有效保護，同時一個液氮罐僅有6個提桶，1個提桶內如果已有凍存的材料，則不能被再次使用，所以保存的次數及保存量大受限制。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的首要目的在于提供一種海帶配子體低溫保存方法，該方法操作簡便、低成本、省時高效、極易推廣。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種海帶配子體低溫冷凍保存方法，包括以下步驟：

（1）材料處理：將培養保存的配子體克隆系進行超聲粉碎后，在溫度8-10℃、光強500-800Lux、光時24h條件下預培養10天，得處理好的配子體克隆系材料；

（2）平衡：取體積分數為10%DMSO溶液1mL加入凍存管中，進行預先冷凍，向預先冷凍的凍存管中再加入0.8mL的10%DMSO溶液，使凍存管中DMSO處于固液混合物狀態，然后向凍存管中加入步驟1處理好的配子體克隆系材料，0-4℃下平衡30min；

（3）冷凍保存：將平衡后的配子體材料放入-80℃低溫冰箱冷凍；

（4）復蘇：將-80℃低溫冷凍保存的凍存管快速放入恒溫水浴中進行快速解凍，解凍后配子體材料經煮沸后冷卻的低溫海水洗滌去除DMSO，移入培養液中培養。

作為本發明的進一步優化，步驟（1）中所述的配子體克隆系為雌雄小団狀配子體克隆系來源于國家海藻工程技術研究中心種質資源室；所述的超聲粉碎是在超聲6s、間隔5s，超聲2次，功率200-300w的程序進行超聲波處理1次。

作為本發明的進一步優化，步驟（2）中所述的預先冷凍是指在-20℃冰箱中冷凍。

作為本發明的進一步優化，步驟（4）中所述的恒溫水浴的溫度為38-39℃，時間為使凍存管中冰晶完全消失為止。