[發明專利]一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310737735.8
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103724424A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 齊珂珂;徐子偉;吳杰
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C07K14/605
• 分類號: C07K14/605;C07K1/18;A61K38/26;A61K47/48;A61P1/00
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術領域

本發明屬于肽或蛋白質的修飾復合物及其制備的技術領域，具體涉及一種單甲氧基聚乙二醇修飾的豬胰高血糖素樣肽-2（porcine?glucagon-like?peptide-2,?pGLP-2），即一種單甲氧基聚乙二醇-豬胰高血糖素樣肽-2復合物及其制備方法和應用。

背景技術

胰高血糖素樣肽-2（glucagon-like?peptide-2,?GLP-2）是胰高血糖素原基因轉錄、翻譯后處理加工的33個氨基酸的胰高血糖素衍生肽之一，主要由遠端回腸和結腸的L細胞分泌。GLP-2通過特異性促進腸上皮增殖、抑制腸上皮凋亡、增加腸道血供、抑制胃酸分泌、降低腸道通透性等多方面促進損傷腸粘膜的結構恢復和屏障功能改善，且作用強于以往發現的其他非特異的腸生長因子，為治療仔豬腸道損傷和功能紊亂提供了廣闊的研究前景。pGLP-2與hGLP-2具有相似的腸道促生長作用，同源性為82%，通過C端延長，含有35個氨基酸。

但是，在豬體內，pGLP-2易被體內廣泛存在的二肽酰肽酶-IV（dipeptidyl?peptidase-IV,?DPP-IV）快速降解掉N端的前兩個氨基酸His¹-Ala²，體內半衰期為8.4min，嚴重制約了其推廣應用。

聚乙二醇（PEG）是一種親水、不帶電荷的線性大分子，蛋白質經PEG修飾后，分子量增加，腎小球的濾過減少，PEG的屏障作用保護了蛋白質不易被蛋白酶水解，有助于蛋白質類藥物半衰期的延長。但蛋白PEG修飾產物的分離純化均比較困難。原因如下：（1）蛋白經PEG修飾后，許多理化性質發生了改變，如等電點、分子質量、溶解度、沉降系數等；（2）PEG分子在水溶液中具有伸展的構象，其流體動力學體積遠遠大于同樣分子質量的球狀蛋白，使得與PEG的分離非常困難；（3）PEG分子的不均一性，存在一定的分子質量分布，因此即使包含相同PEG個數的同一種蛋白質，其相對分子量也不完全相同；（4）蛋白質表面可修飾的氨基酸位點較多時，PEG分子可結合在多個不同的氨基酸殘基上，使PEG修飾蛋白的空間結構進一步復雜化。以上為蛋白PEG修飾及產品開發的核心與難點所在。

目前，通過PEG修飾pGLP-2延長其半衰期治療仔豬腸道疾病的研究未見報道。

發明內容

針對pGLP-2中僅含有一個Lys殘基的優勢，本發明的第一個目的是提供一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物，該復合物得到單點修飾產物，從而避免了修飾位點的多態性，使后續純化簡便。mPEG-SPA-pGLP-2復合物保留了pGLP-2的生物學活性，與pGLP-2相比，半衰期延長，可更方便地應用于腸道疾病的治療。本發明的第二個目的是提供上述的一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制備方法。本發明的本發明的第三個目的是提供上述的一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物的制藥用途。

為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案：

一種mPEG-SPA-pGLP-2復合物，由豬胰高血糖素樣肽-2（porcine?glucagon-like?peptide-2,?pGLP-2）與單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯（methoxy-polyethylene?glycol-succinimidyl-propionic?acid?ester,?mPEG-SPA）通過加成反應連接構成，所述pGLP-2第30位的Lys與所述mPEG-SPA的末端雙鍵形成共價鍵而連接。

作為優選，所述的pGLP-2的氨基酸序列為：His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Leu-His-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-NH₂。

作為優選，所述單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酸酯的分子量為5~20KD。

為了實現上述的第二個目的，本發明采用了以下的技術方案：

一種制備上述任一技術方案所述的mPEG-SPA-pGLP-2復合物的方法，該方法包括以下的步驟：

1）將pGLP-2制備成pH為7.5~9.0的溶液；

2）將步驟1）制備的pGLP-2溶液與mPEG-SPA反應，所述pGLP-2與mPEG-SPA的摩爾濃度比為1：1~1：8，反應溫度為4~37℃，反應時間為0.5~24小時；