[發(fā)明專利]同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310737490.9
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN103773854A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊雷亮;孫麗霞;陳定虎;邱德義;王章根;管維
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國中山出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77
• 代理公司: 南京理工大學(xué)專利中心 32203
• 代理人: 朱顯國

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于LAMP技術(shù)同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種與4號(hào)生理小種的LAMP方法。

背景技術(shù)

香蕉枯萎病，又稱香蕉巴拿馬病、香蕉黃葉病，是一種重要的、最具毀滅性的香蕉病害之一，給香蕉種植業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。該病屬維管束型土傳真菌病害，可通過種苗、土壤、流水和人為因素傳播，故對枯萎病的預(yù)防和控制是一個(gè)世界性難題。香蕉枯萎病菌(Fusarium?oxysporum?f.?sp.?cubense)是植物病害中系統(tǒng)浸染、土壤傳播、抗逆性強(qiáng)、致病性變異較大的病原菌之一，極難防治。因此,?我國2007年將其列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。準(zhǔn)確、快速地鑒定香蕉病菌，對于做好我國香蕉檢疫和防治工作具有重要意義。

目前國內(nèi)通用的GB、SN等標(biāo)準(zhǔn)采用培養(yǎng)接種等生物學(xué)檢測方法和PCR、基因芯片和測序比對等分子生物學(xué)檢測方法輔助相結(jié)合的方法，檢驗(yàn)周期需要2-7天，且操作復(fù)雜，成本較高，難以適應(yīng)當(dāng)代貿(mào)易中快速檢驗(yàn)的客觀需求。尤其是在田間地頭和碼頭海港等野外工作條件下，不具備PCR往往無法開展快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種與4號(hào)生理小種的LAMP方法，以滿足對出入境檢驗(yàn)檢疫中尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種與4號(hào)生理小種的鑒定。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案為：

同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法，所述檢測方法包括LAMP?引物的設(shè)計(jì)與合成、模板DNA的提取、LAMP?擴(kuò)增體系建立，LAMP?擴(kuò)增方法，所述的LAMP?擴(kuò)增方法反應(yīng)溫度為63℃左右、反應(yīng)在90min?內(nèi)完成擴(kuò)增，引物包括外引物、內(nèi)引物；

所述的外引物是F3?和B3?；

所述的內(nèi)引物是FIP?和BIP；

所述引物序列自5'?端到3'?端如下：

F3：TTGCACCAGAAACGGTAT

B3：TTGCACCAGAAACGGTAT

FIP：TATCAGCTTGCTCCCCTGC-CGATGACCTCAATAACAAAACC

BIP：AGAGGCATAATTGGTTGTAGTGC-TTTTTTGGTGGCCCATGT

????其中，所述模板DNA提取指植物或菌體組織DNA的提取，離心提取其核酸，具體步驟為：

稱取80mg樣品，加入到2ml的離心管中；加入600μL裂解液充分混勻。65℃溫浴至少30分鐘。然后加入300μL蛋白沉淀液，13000rpm離心4min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5ml離心管中；若上清很混濁可以再加等體積的氯仿/異戊醇（24：1）顛倒混勻，13000rpm離心4min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中；加入0.8倍體積異丙醇，-20℃沉淀30min。13000rpm離心4min，棄上清，加入600μL?70%乙醇，13000rpm離心4min，棄上清，晾干，加TE溶液30μL溶解。

????所述LAMP?擴(kuò)增體系建立是采用水溶液配置，體系總體積25μL，其中包括：

模板DNA???2μL

2×U-LAMP?MIX??17μL

F3??5uM，?1μL

B3??5uM，?1μL?

FIP?40uM，?1μL

BIP?40uM，?1μL

Bst?DNA?酶????8?U/μL，?1μL

熒光染料??1μL。

????所述LAMP擴(kuò)增方法采用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，將按照LAMP擴(kuò)增體系配制好的試劑加入反應(yīng)器中，63℃左右反應(yīng)1小時(shí)，共分為40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)1分鐘30秒，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光。

所述LAMP擴(kuò)增方法采用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴(kuò)增體系配制好的試劑加入PE管中，放入63℃左右水浴鍋中保溫90min，然后取出放入另一80℃水浴鍋中保溫10?min后，取出。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其顯著優(yōu)點(diǎn)是：

1、兼顧兩個(gè)生理小種，同時(shí)檢測無遺漏。能夠同時(shí)檢測出植物或菌體組織中的尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)生理小種與4號(hào)生理小種。

2、操作簡便，成本低廉。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法是具有與PCR技術(shù)同等甚至超越的優(yōu)勢，加之對儀器設(shè)備要求寬松，不用PCR儀，簡單易行，周期短至1小時(shí)，可縮短檢驗(yàn)周期50%以上，可實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測，適合進(jìn)行現(xiàn)場及大量樣品的高通量檢測。