[發明專利]同時檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號與4號小種的LAMP方法無效

申請號：	201310737490.9	申請日：	2013-12-30
公開（公告）號：	CN103773854A	公開（公告）日：	2014-05-07
發明（設計）人：	楊雷亮;孫麗霞;陳定虎;邱德義;王章根;管維	申請（專利權）人：	中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77
代理公司：	南京理工大學專利中心 32203	代理人：	朱顯國
地址：	528403***	國省代碼：	廣東;44
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	同時檢測鐮刀古巴專化型號小種 lamp 方法
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種基于LAMP技術同時檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種與4號生理小種的LAMP方法。

背景技術

香蕉枯萎病，又稱香蕉巴拿馬病、香蕉黃葉病，是一種重要的、最具毀滅性的香蕉病害之一，給香蕉種植業造成嚴重損失。該病屬維管束型土傳真菌病害，可通過種苗、土壤、流水和人為因素傳播，故對枯萎病的預防和控制是一個世界性難題。香蕉枯萎病菌(Fusarium?oxysporum?f.?sp.?cubense)是植物病害中系統浸染、土壤傳播、抗逆性強、致病性變異較大的病原菌之一，極難防治。因此,?我國2007年將其列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。準確、快速地鑒定香蕉病菌，對于做好我國香蕉檢疫和防治工作具有重要意義。

目前國內通用的GB、SN等標準采用培養接種等生物學檢測方法和PCR、基因芯片和測序比對等分子生物學檢測方法輔助相結合的方法，檢驗周期需要2-7天，且操作復雜，成本較高，難以適應當代貿易中快速檢驗的客觀需求。尤其是在田間地頭和碼頭海港等野外工作條件下，不具備PCR往往無法開展快速檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種同時檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種與4號生理小種的LAMP方法，以滿足對出入境檢驗檢疫中尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種與4號生理小種的鑒定。

實現本發明的技術方案為：

同時檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號與4號小種的LAMP方法，所述檢測方法包括LAMP?引物的設計與合成、模板DNA的提取、LAMP?擴增體系建立，LAMP?擴增方法，所述的LAMP?擴增方法反應溫度為63℃左右、反應在90min?內完成擴增，引物包括外引物、內引物；

所述的外引物是F3?和B3?；

所述的內引物是FIP?和BIP；

所述引物序列自5'?端到3'?端如下：

F3：TTGCACCAGAAACGGTAT

B3：TTGCACCAGAAACGGTAT

FIP：TATCAGCTTGCTCCCCTGC-CGATGACCTCAATAACAAAACC

BIP：AGAGGCATAATTGGTTGTAGTGC-TTTTTTGGTGGCCCATGT

????其中，所述模板DNA提取指植物或菌體組織DNA的提取，離心提取其核酸，具體步驟為：

稱取80mg樣品，加入到2ml的離心管中；加入600μL裂解液充分混勻。65℃溫浴至少30分鐘。然后加入300μL蛋白沉淀液，13000rpm離心4min。將上清液轉移至另一干凈的1.5ml離心管中；若上清很混濁可以再加等體積的氯仿/異戊醇（24：1）顛倒混勻，13000rpm離心4min,將上清液轉移至另一干凈的離心管中；加入0.8倍體積異丙醇，-20℃沉淀30min。13000rpm離心4min，棄上清，加入600μL?70%乙醇，13000rpm離心4min，棄上清，晾干，加TE溶液30μL溶解。

????所述LAMP?擴增體系建立是采用水溶液配置，體系總體積25μL，其中包括：

模板DNA???2μL

2×U-LAMP?MIX??17μL

F3??5uM，?1μL

B3??5uM，?1μL?

FIP?40uM，?1μL

BIP?40uM，?1μL

Bst?DNA?酶????8?U/μL，?1μL

熒光染料??1μL。

????所述LAMP擴增方法采用實時熒光PCR儀，將按照LAMP擴增體系配制好的試劑加入反應器中，63℃左右反應1小時，共分為40個循環，每個循環1分鐘30秒，每個循環結束時收集熒光。

所述LAMP擴增方法采用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴增體系配制好的試劑加入PE管中，放入63℃左右水浴鍋中保溫90min，然后取出放入另一80℃水浴鍋中保溫10?min后，取出。

本發明與現有技術相比其顯著優點是：