[發(fā)明專利]同時(shí)檢測(cè)尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310737490.9
• 申請(qǐng)日: 2013-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN103773854A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊雷亮;孫麗霞;陳定虎;邱德義;王章根;管維
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中華人民共和國(guó)中山出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/77
• 代理公司: 南京理工大學(xué)專利中心 32203
• 代理人: 朱顯國(guó)

1.一種同時(shí)檢測(cè)尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法，其特征在于：所述檢測(cè)方法包括LAMP?引物的設(shè)計(jì)與合成、模板DNA的提取、LAMP?擴(kuò)增體系建立，LAMP?擴(kuò)增方法，所述的LAMP?擴(kuò)增方法反應(yīng)溫度為63℃左右、反應(yīng)在90min?內(nèi)完成擴(kuò)增，引物包括外引物、內(nèi)引物；

所述的外引物是F3?和B3?；

所述的內(nèi)引物是FIP?和BIP；

所述引物序列自5'?端到3'?端如下：

F3：TTGCACCAGAAACGGTAT

B3：TTGCACCAGAAACGGTAT

FIP：TATCAGCTTGCTCCCCTGC-CGATGACCTCAATAACAAAACC

BIP：AGAGGCATAATTGGTTGTAGTGC-TTTTTTGGTGGCCCATGT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述模板DNA提取指植物或菌體組織DNA的提取。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述LAMP?擴(kuò)增體系建立是采用水溶液配置，體系總體積25μL，其中包括：

模板DNA???2μL

2×U-LAMP?MIX?????17μL

F3???5uM，?1μL

B3??5uM，?1μL?

FIP?40uM，?1μL

BIP?40uM，?1μL

Bst?DNA?酶??????????8?U/μL，?1μL

熒光染料??1μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述LAMP擴(kuò)增方法采用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，將按照LAMP擴(kuò)增體系配制好的試劑加入反應(yīng)器中，63℃左右反應(yīng)1小時(shí)，共分為40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)1分鐘30秒，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述LAMP擴(kuò)增方法采用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴(kuò)增體系配制好的試劑加入PE管中，放入63℃左右水浴鍋中保溫90min，然后取出放入另一80℃水浴鍋中保溫10?min后，取出。