[發(fā)明專利]人源化抗體表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310737306.0
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103898141A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 萬曉春;呂衛(wèi)東
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/70
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于載體構(gòu)建領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種人源化抗體表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

由于單克隆抗體的高度特異性，使其在細(xì)胞生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷、治療等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但同時單克隆抗體也存在一些缺陷，鼠源性抗體應(yīng)用于人體會產(chǎn)生抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)等,會妨礙其在臨床上的應(yīng)用。為了克服單克隆抗體的缺點，利用基因工程技術(shù)制備嵌合抗體，人源化抗體等，在盡量保留原有抗體的特異性的前提下減少了抗體中的鼠源成分。

目前構(gòu)建嵌合抗體，完整的人源化抗體等一般需要先擴(kuò)增出人源性抗體的輕重鏈恒定區(qū)基因，然后通過重疊PCR的方法與所需表達(dá)抗體的可變區(qū)相連后再構(gòu)建至表達(dá)載體中，該過程比較費時、費力。

另外目前常用的噬菌體抗體庫等篩選方法所篩選出來的抗體一般為ScFv，F(xiàn)ab等，還需要進(jìn)一步構(gòu)建全長的完整抗體。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種完整的人源化抗體的表達(dá)載體的快速構(gòu)建方法。

一種人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將堿基組成如SEQ?ID?NO:6所示的含有2A序列的輕鏈λ的恒定區(qū)基因序列CL-2A與堿基組成如SEQ?ID?NO:7所示的重鏈γ1的恒定區(qū)基因序列CH分別與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆，得到pMD18-T-CL-2A質(zhì)粒和pMD18-T-CH質(zhì)粒；

(2)將pMD18-T-CL-2A質(zhì)粒和真核表達(dá)載體分別用HindIII和BamHI進(jìn)行雙酶切，將分離純化后的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得含CL-2A的真核表達(dá)載體；

(3)將步驟(2)的含CL-2A的真核表達(dá)載體和步驟(1)的pMD18-T-CH質(zhì)粒分別用XbaI和XhoI進(jìn)行雙酶切，將分離純化后的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選獲得人源化抗體表達(dá)載體。

在其中一個實施例中，所述含有2A序列的輕鏈λ的恒定區(qū)基因序列CL-2A是通過以下步驟制備得到的：

將健康人淋巴細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，以單鏈cDNA為模板，SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2為擴(kuò)增引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；以所述PCR產(chǎn)物為模板，SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:3為擴(kuò)增引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到含有2A序列的輕鏈λ的恒定區(qū)基因序列CL-2A。其中，

C_L上游引物：AAGCTTCAGCCCAAGGCTGCCCCCT(SEQ?ID?NO:1)，含有HindIII酶切位點；

C_L下游引物1：

CCAACTTGAGCAGGTCAAAGTTCAAAAGCTGCTATGAACATTCTGTAGG(SEQ?ID?NO:2)

C_L下游引物2：

GGATCCGGGCCCAGGATTGGACTCAACGTCCCCCGCCAACTTGAGCAGGTCAA(SEQ?ID?NO:3)，含有BamHI酶切位點；

C_L下游引物1、2中包含了2A的序列，由于2A的序列較長，因此使用兩次PCR反應(yīng)以便把完整的2A的基因序列添加到CL鏈的末端。

在其中一個實施例中，所述第一次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。

在其中一個實施例中，所述第二次PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。

在其中一個實施例中，所述重鏈γ1的恒定區(qū)基因序列CH是通過以下步驟制備得到的：

以全長人源性質(zhì)粒H為模板，SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到重鏈γ1的恒定區(qū)基因序列CH。其中：

C_H上游引物：CTCGAGGCCTCCACCAAGGGCCCAT(SEQ?ID?NO:4)