[發明專利]人源化抗體表達載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201310737306.0
• 申請日: 2013-12-26
• 公開（公告）號: CN103898141A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 萬曉春;呂衛東
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/70
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

1.一種人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將堿基組成如SEQ?ID?NO:6所示的含有2A序列的輕鏈λ的恒定區基因序列CL-2A與堿基組成如SEQ?ID?NO:7所示的重鏈γ1的恒定區基因序列CH分別與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，得到pMD18-T-CL-2A質粒和pMD18-T-CH質粒；

(2)將pMD18-T-CL-2A質粒和真核表達載體分別用HindIII和BamHI進行雙酶切，將分離純化后的酶切產物進行連接，轉化大腸桿菌，篩選獲得含CL-2A的真核表達載體；

(3)將步驟(2)的含CL-2A的真核表達載體和步驟(1)的pMD18-T-CH質粒分別用XhoI和XbaI進行雙酶切，將分離純化后的酶切產物進行連接，轉化大腸桿菌，篩選獲得人源化抗體表達載體。

2.根據權利要求1所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，所述含有2A序列的輕鏈λ的恒定區基因序列CL-2A是通過以下步驟制備得到的：

將健康人淋巴細胞的總RNA，反轉錄成單鏈cDNA，以單鏈cDNA為模板，SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2為擴增引物，進行第一次PCR擴增，得到PCR產物；以所述PCR產物為模板，SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:3為擴增引物，進行第二次PCR擴增，得到含有2A序列的輕鏈λ的恒定區基因序列CL-2A。

3.根據權利要求1所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，所述重鏈γ1的恒定區基因序列CH是通過以下步驟制備得到的：

以全長人源性質粒H為模板，SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5為擴增引物，進行PCR擴增，得到重鏈γ1的恒定區基因序列CH。

4.根據權利要求2所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，所述第一次PCR擴增的反應體系為：

反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環后，72℃延伸10min。

5.根據權利要求2所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，所述第二次PCR擴增的反應體系為：

反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環后，72℃延伸10min。

6.根據權利要求3所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系為：

反應程序為：94℃預變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，30個循環后，72℃延伸10min。

7.根據權利要求1所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(1)中所述連接體系為：

pMD18-T載體?????????????0.5μL

CL-2A/CH????????????????4.5μL

Solution?Ⅰ?????????????5μL

所述連接條件為22℃連接5h。

8.根據權利要求1所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(1)-步驟(3)中所述轉化包括以下步驟：

(a)于30μL大腸桿菌DH5α感受態細胞中加入2μL連接產物，輕輕旋動以混勻，冰中放置30min；

(b)42℃水浴熱激90s；

(c)迅速轉移到冰浴中放置2min；

(d)加入1mLLB培養基，于37℃，160rpm振蕩培養1h；

(e)取100μL培養液涂布到含有Amp的LB瓊脂平板培養基上，將平板置于37℃放置1h后倒置平皿，于37℃培養過夜。

9.根據權利要求1所述的人源化抗體表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述真核表達載體為pcDNA3.1。

10.權利要求1-9任一項所述的構建方法得到的人源化抗體表達載體。