[發明專利]一種用于檢測豬細小病毒和豬圓環病毒2型病毒及其混合感染的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201310737274.4
• 申請日: 2013-12-24
• 公開（公告）號: CN103820572A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 張志剛;董劍輝;張文利;張曉杰;李爽
• 申請（專利權）人: 北京偉嘉人生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明提供了一種檢測豬細小病毒、豬圓環病毒2型病毒及其混合感染的試劑盒和方法，屬于生物技術領域。?

技術背景

豬細小病毒(Porcine?parvovirus，PPV)、豬圓環病毒2型病毒(Porcine?circocirus?type2，PCV2)是目前常見的引起豬繁殖障礙病的DNA病毒。目前，?

很多豬場都存在上述病毒引起的疾病，給養豬業造成巨大的經濟損失。臨床上常呈現混合感染，主要表現為受感染母豬產死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，不容易區分。?

發明內容

本發明的一個目的是提供一種檢測豬細小病毒和豬圓環病毒2型病毒的核?

苷酸引物，分別為PPVF、PPVR、PCV2F和PCV2R，其中序列PPVF和PPVR為檢測豬細小病毒的正義引物和反義引物，序列PCV2F和PCV2R為檢測豬圓環病毒2型的正義引物和反義引物。?

本發明的第二個目的是提供一種用于檢測豬細小病毒和豬圓環病毒2型病?

毒的試劑盒，由以下組分組成：(1)DNA提取試劑為購自北京康為世紀生物技術有限公司的DNA提取試劑盒；(2)2×PCR?Mix，包含終濃度為0.4mM的dNTP、4.0mM的MgSO4、80mM的KC1、20mM的Tris-C1和0.1U/μL的Taq?DNA聚合酶；(3)引物混合液，含終濃度12μM的豬細小病毒正義引物和反義引物，同時含終濃度為10μM的豬圓環病毒2型正義引物和反義引物；(4)DNA陽性對照，包含35μg/mLPPV和30μg/mLPCV2；(5)陰性對照：DEPC水；(6)高壓滅菌水；?

本發明的第三個目的是提供一種用于檢測豬細小病毒和豬圓環病毒2型病毒及其混合感染的方法，包括如下步驟：?

(1)提取樣品總DNA；?

(2)用權利要求1中所述引物對待測樣本進行PCR擴增，PCR反應體系為：2×PCRMix12.5μL、引物混合液2μL、模板1μL、高壓滅菌水9.5μL，總體積25μL；擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30S，57℃退火30S，72℃延伸45S，循環35cycles，最后72℃延伸8min。同時設陰性對照和陽性對照，陽性對照含?

35μg/mLPPV和30μg/mLPCV2，陰性對照為DEPC水；?

(3)電泳；?

(4)結果分析。?

本發明的實驗證明，本發明提供的豬細小病毒和豬圓環病毒2型兩重PCR檢測方法，一次反應能同時檢測出PPV和PCV2兩種病毒，所用2對引物特異性較好，引物相互之間有較低的同源性及互補性，所述引物敏感性較好。該方法具有簡便、快速、經濟、高效等優勢，利于臨床的大量檢測，在臨床診斷上具有較好的應用前景。?

附圖說明

圖1為PPV、PCV2兩重PCR以及單項PCR電泳圖結果?

圖2為PPV、PCV2兩重PCR特異性電泳圖結果?

圖3(3a、3b)為PPV、PCV2兩重PCR敏感性電泳圖結果?

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。?

實施例1豬細小病毒(PPV)、豬圓環病毒2型病毒(PCV2)、兩重PCR檢測方法?建立。?

1引物設計：在GenBank中查找多個毒株，對其進行同源性分析，利用Primer5對上述保守區進行引物設計，對設計出來的兩種病毒引物進行引物二聚體分析，以避免引物之間形成穩定的引物二聚體，并對每對引物的擴增序列進行同源性或互補性分析，避免它們之間有較高的同源性或互補性，從而確定2種病毒的引物序列，見表1。?

表1?

2、PCR反應條件優化?