[發(fā)明專利]制備高分子量透明質(zhì)酸的方法及工程菌

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310737032.5
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103993031A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉浩;王震
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12P19/26;C12R1/46
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及獸疫鏈球菌基因組中透明質(zhì)酸裂解酶基因的敲除，尤其是一種制備高分子量透明質(zhì)酸的方法及工程菌。

背景技術(shù)

高分子量透明質(zhì)酸在化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域占有重要的地位，其制備方法也是當(dāng)前生物技術(shù)的難點和熱點，用于制備高分子量透明質(zhì)酸的方法主要為動物提取法。

動物組織提取法，透明質(zhì)酸（HA）幾乎存在于所有的動物組織中，能夠用于生產(chǎn)的原料主要為人臍帶、動物眼球和雞冠。主要的工藝過程包括提取、除雜、酶解、沉淀和分離。此方法主要存在：原料來源局限性大，產(chǎn)品提取率極低，工藝程序復(fù)雜，生產(chǎn)成本居高不下，可能產(chǎn)生病毒種間交叉感染等缺點。

微生物發(fā)酵法，鏈球菌屬的多種細(xì)菌都有以HA為主要成分的莢膜，在生長繁殖過程中，向胞外分泌以HA為主要成分的莢膜，經(jīng)分離純化即可得高純度HA產(chǎn)品。與動物組織提取法相比，微生物發(fā)酵法具有成本低，生產(chǎn)規(guī)模不受動物原料限制，發(fā)酵液中HA以游離狀態(tài)存在，易于分離純化和形成規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，無動物來源的致病菌污染等優(yōu)勢。隨著微生物基因組內(nèi)與HA相關(guān)重要酶基因的克隆,構(gòu)建基因工程菌成為提高分子量的研發(fā)熱點。

基因插入失活是一種遺傳工程技術(shù)，是基因敲除(knockout)技術(shù)的一種。針對某個序列已知但功能未知的序列，在基因內(nèi)部插入一段抗性基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進(jìn)一步對生物體造成影響，進(jìn)而推測出該基因的生物學(xué)功能。

透明質(zhì)酸酶，在透明質(zhì)酸（HA）分子酶解過程中發(fā)揮主要左右，它能夠在HA分子內(nèi)部隨機(jī)對HA分子進(jìn)行切割，生成HA小分子片段，降低HA分子間的相互作用，釋放被束縛的水分子，能降解β-1,3糖苷鍵及β-1,4糖苷鍵的酶再作用于HA小分子片段。敲除透明質(zhì)酸裂解酶可以有效的抑制透明質(zhì)酸的酶解，從而得到高分子量的HA。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種制備高分子量透明質(zhì)酸的方法及工程菌，通過構(gòu)建一種透明質(zhì)酸裂解酶基因hylb敲除載體，將敲除載體轉(zhuǎn)入宿主菌，通過同源重組使hylb基因失活，利用抗性篩選標(biāo)記獲得hylb基因功能缺失的工程菌，將工程菌發(fā)酵獲得分子量為3.9×10⁶Da的透明質(zhì)酸。

本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先以Streptococcus?zooepidemicusATCC39920菌株基因組為模板克隆透明質(zhì)酸裂解酶基因hylb內(nèi)部1683bp基因片段，以溫度敏感型質(zhì)粒pSET4s(NCBI?gene?Bank:AB055650.1)為出發(fā)載體，插入透明質(zhì)酸裂解酶基因hylb內(nèi)部1683bp基因片段，構(gòu)建中間載體pSET4s::hylb，以pSET1(NCBI?gene?Bank:AB042426.1)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增包含cmr基因長度為1056bp的基因片段，將此片段插入到中間載體pSET4s::hylb中hylb基因內(nèi)部的DraIII位點，構(gòu)建敲除載體pSET4s::hylb::cmr。將敲除載體pSET4s::hylb::cmr電轉(zhuǎn)入Streptococcus?zooepidemicus?ATCC39920感受態(tài)細(xì)胞，利用同源序列DNA分子之間的重新組合，將包含cmr基因長度為1056bp的基因片段將插入到hylb基因內(nèi)部，使hylb基因失活，從而得到hylb基因敲除菌株。將敲除菌株在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)24h，取適量不同時間點的發(fā)酵液，處理后，利用特性黏度法測定HA的分子量，獲得分子量為3.9×10⁶Da的透明質(zhì)酸。

一種含有透明質(zhì)酸裂解酶基因的載體，所述的載體將hylb基因內(nèi)部1683bp基因片段插入初始載體pSET4s中，構(gòu)建了中間載體pSET4s::hylb，再將一段包含氯霉素抗性基因cmr長度為1056bp的基因片段插入到hylb基因片段中的DraIII位點，形成載體pSET4s::hylb::cmr。

而且，所述hylb基因內(nèi)部1683bp基因片段始于hylb基因起始密碼子ATG下游202bp，結(jié)束于hylb基因終止密碼子TAG上游1310bp，基因序列見序列1。

而且，所述一段包含氯霉素抗性基因cmr長度為1056bp的基因序列見序列2。

一種載體pSET4s::hylb::cmr轉(zhuǎn)入宿主菌,特異性敲除透明質(zhì)酸裂解酶基因hylb,獲得hylb基因功能缺失的工程菌。

而且，所述工程菌的宿主菌為獸疫鏈球菌（Streptococcus?zooepidemicus）ATCC39920。