[發(fā)明專利]一種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310733452.6
• 申請(qǐng)日: 2013-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN104745530A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 代智;許春花;樊嘉;周儉;胥甜甜;胡剛;吳偉忠;湯旭蓁;秦宵然
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院;上海睿智化學(xué)研究有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;A01K67/027;A61K49/00;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 朱水平;沈利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞系領(lǐng)域，特別涉及一種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

原發(fā)性肝癌具有發(fā)病例高、預(yù)后較差及病死率高等特點(diǎn)，是常見的惡性腫瘤的一種。據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肝癌全球新發(fā)例數(shù)約74.8萬，死亡病例69.6萬，而其中半數(shù)發(fā)生在中國(guó)。其發(fā)病例和死亡率在男性腫瘤患者中分別居于第5位，第2位；在女性腫瘤患者中分別居于第7位和第6位。

原發(fā)性肝癌起病隱匿，早期缺乏典型癥狀，早期診斷較困難，病程發(fā)展快，一旦癥狀明顯，自行就診患者多屬于中晚期。晚期肝癌患者常有肝區(qū)疼痛、食欲減退、乏力、消瘦和肝腫大等癥狀。少數(shù)晚期患者表現(xiàn)為惡病質(zhì)狀。惡病質(zhì)是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)異常的綜合征，60%～80%晚期腫瘤患者都存在此綜合征。臨床表現(xiàn)為極度消瘦、營(yíng)養(yǎng)攝入不足、肌力軟弱、厭食等，是癌癥患者死亡的主要原因之一。盡管臨床上對(duì)惡病質(zhì)的認(rèn)識(shí)較早，但至今其發(fā)生機(jī)制仍未得到完全闡明，從而限制了有明確理論依據(jù)、針對(duì)性強(qiáng)的治療手段的發(fā)展。目前報(bào)道的應(yīng)用于研究的肝癌細(xì)胞系，所建成的動(dòng)物模型表現(xiàn)為惡病質(zhì)的非常少，建立這樣一種細(xì)胞系，可以為進(jìn)一步研究惡病質(zhì)的發(fā)生機(jī)制提供材料，也可以為篩選治療改善惡病質(zhì)癥狀的藥物提供平臺(tái)。

體外建立肝癌細(xì)胞系是研究肝癌機(jī)制、探索其治療方法必不可少的手段，但包括肝癌細(xì)胞在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)建系均非常困難，原發(fā)腫瘤組織由于離體后環(huán)境變化，細(xì)胞往往會(huì)發(fā)生衰退死亡，導(dǎo)致體外細(xì)胞建系的成功率極低，即使能在體外生存，也常發(fā)生某些生物學(xué)特性的改變或丟失。

另一方面，臨床60%-80%腫瘤晚期病人受惡病質(zhì)痛苦，因此，建議惡病質(zhì)動(dòng)物模型，對(duì)于腫瘤的研究顯得格外重要。但是鮮有技術(shù)中，鮮少有肝癌細(xì)胞系能夠?qū)崿F(xiàn)上述功能，極大的制約了對(duì)于腫瘤研究的進(jìn)展，該現(xiàn)象亟待解決。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系存在的生物多樣性低，與臨床上肝癌的生物學(xué)性狀相差較大的不足，而提供一種新的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。本發(fā)明的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，具有成瘤性，可以成功制備肝癌動(dòng)物模型，可用來分析體外、體內(nèi)藥物敏感性進(jìn)而建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的藥物篩選平臺(tái)，是應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系，并且，本發(fā)明的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系可建立惡病質(zhì)動(dòng)物模型的特性，使得通過原代培養(yǎng)建立的人源腫瘤細(xì)胞更接近于腫瘤的臨床生物學(xué)特性，對(duì)藥物的耐藥性及敏感性將具有更好的預(yù)測(cè)性，可用于臨床前抗腫瘤藥物的篩選，為進(jìn)一步研究惡病質(zhì)的發(fā)生機(jī)制和藥物篩選提供了難得的材料。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，其保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C201114。

本發(fā)明還提供如上所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞。

本發(fā)明還提供如上所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的用途，用于制備在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生肝癌的試劑。所述的哺乳動(dòng)物為本領(lǐng)域常規(guī)的哺乳動(dòng)物，較佳地為免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠較佳地為SCID小鼠或Nu/Nu裸小鼠。所述的肝癌較佳地為低分化或中分化肝細(xì)胞癌。

本發(fā)明還提供一種上述人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的建立方法，所述的建立方法包括以下步驟：

1）獲得新鮮的臨床肝癌手術(shù)切除標(biāo)本，切成20～50mg的小塊，接種哺乳動(dòng)物；

2）接種70～90天后，將荷瘤動(dòng)物處死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。

其中，所述的哺乳動(dòng)物、所述的肝癌都如上所述。

所述的新鮮的臨床肝癌手術(shù)切除標(biāo)本較佳地用新鮮的HBSS緩沖液（含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸鏈霉素和1.25μg/mL兩性霉素B）漂洗后，再進(jìn)行皮下穿刺接種。

所述的接種的方式可以是皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內(nèi)接種。對(duì)于肝癌，所述的接種的方式較佳地為皮下穿刺接種。