[發(fā)明專(zhuān)利]一種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310733452.6
• 申請(qǐng)日: 2013-12-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104745530A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 代智;許春花;樊嘉;周儉;胥甜甜;胡剛;吳偉忠;湯旭蓁;秦宵然
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院;上海睿智化學(xué)研究有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/09
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/09;A01K67/027;A61K49/00;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 朱水平;沈利

1.一種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，其特征在于：所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C201114。

2.如權(quán)利要求1所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求1或2所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的用途，其特征在于：所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系用于制備在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生肝癌的試劑。

4.如權(quán)利要求3所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的用途，其特征在于：所述的哺乳動(dòng)物為免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠為SCID小鼠或Nu/Nu裸小鼠。

5.如權(quán)利要求3所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的用途，其特征在于：所述的肝癌為低分化或中分化肝細(xì)胞癌。

6.一種如權(quán)利要求1或2所述的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的建立方法，其特征在于：所述的建立方法包括以下步驟：

1）獲得新鮮的臨床肝癌手術(shù)切除標(biāo)本，切成20～50mg的小塊，接種哺乳動(dòng)物；

2）接種70～90天后，將荷瘤動(dòng)物處死，取出腫瘤組織，進(jìn)行癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。

7.如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的哺乳動(dòng)物為免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠為SCID小鼠或Nu/Nu裸小鼠。

8.如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的新鮮的臨床肝癌手術(shù)切除標(biāo)本用HBSS緩沖液漂洗后，再進(jìn)行皮下穿刺接種；所述的HBSS緩沖液包括500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸鏈霉素和1.25μg/mL兩性霉素B。

9.如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的原代培養(yǎng)方法包括以下步驟：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱5%CO₂條件下培養(yǎng)；次日，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)平放，向瓶?jī)?nèi)加入DMEM/F12培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出的細(xì)胞布滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部；其中，所述的DMEM/F12培養(yǎng)液包括：10ng/mL重組人表皮生長(zhǎng)因子，10μg/mL重組人胰島素，6.7ng/mL亞硒酸鈉，5.5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，2μg/mL乙醇胺，0.1%牛血清白蛋白，100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸鏈霉素和0.25μg/mL兩性霉素B。

10.如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于：所述的傳代培養(yǎng)方法包括以下步驟：吸棄進(jìn)行原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，向培養(yǎng)瓶中加入0.05%胰蛋白酶溶液，待細(xì)胞脫落后，加入DMEM/F12培養(yǎng)液，吹打，使之脫離瓶壁形成細(xì)胞懸液；在瓶壁上變圓但沒(méi)有脫落的細(xì)胞，用無(wú)菌細(xì)胞刮刀掛擦培養(yǎng)瓶表面；收集全部細(xì)胞，離心，分別接種于新的培養(yǎng)瓶；當(dāng)細(xì)胞傳代到第五代以后，將培養(yǎng)液更換為RPMI1640培養(yǎng)液，即可。